慢性蜜蜂麻痹病毒中国株RNA1序列克隆及进化分析

李贝贝 侯春生 刁青云

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性蜜蜂麻痹病毒中国株RNA1序列克隆及进化分析

李贝贝 侯春生 刁青云

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性麻痹病是成蜂中的一种传染性疾病，患病蜜蜂呈现一些神经性行为如颤抖、爬行，能引起两种不同的症状，可导致蜜蜂体表发黑光亮无毛或腹部膨大。该病的病原体是慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus，以下简称CBPV），对其致病性起决定性作用的是RNA依赖RNA聚合酶（RdRp），而RdRp位于CBPV基因组的RNA1片段上。为了深入理解CBPV的感染特点及致病机理，本文克隆中国北京株CBPV RNA1的全基因组序列并对其进行了遗传进化分析，为深入开展病毒研究提供信息数据。

慢性蜜蜂麻痹病毒；序列分析；RNA依赖的RNA聚合酶；进化特点

1 引言

蜜蜂是粮食作物开花授粉的重要媒介昆虫之一，不仅为人类提供多种多样的蜂产品而且通过授粉产生更大的经济效益。在世界农业范围内蜜蜂通过授粉创造的价值约为1750亿美元[1]，仅在欧洲和北美大约为170～180亿美元[2，3]。但是蜜蜂的健康正受到多个病原及环境压力的影响，从寄生性瓦螨、RNA病毒和微孢子虫等致病因子到环境中的农药等，都会导致蜂群数量持续下降[4，5]。尤其是自2007年发现IAPV是引起蜜蜂崩溃症的主要病毒之一，病毒病被发现在全球分布广泛且危害巨大。同样，CBPV在近两年对我国蜂群造成了较大的影响，分布也较广。

慢性麻痹病是成蜂中的一种传染性疾病，在1963年被首次发现[6]。其感染主要的症状是：行为上，患病蜜蜂身体颤抖，翅膀不对称外翻状态和只能在地上爬行不能飞行，几天后巢门口聚集大量死蜂；体表上，蜜蜂体色发黑或腹部膨大。大多数情况下主要通过食物和表皮伤口传播，健康蜂通过与病蜂接触或者哺育蜂清理病蜂粪便时被感染[7]。

CBPV是长度30～60 nm，宽度20 nm的非等轴无包膜病毒粒子[8]。它是单链正义RNA病毒，由两段基因组成，分别是 RNA1和 RNA2，已知的参考株（EU122229）RNA1长度3674个核苷酸，（EU122230）RNA2包含2305个核苷酸[9]，有实验显示CBPV的RNA3’端不含多聚腺苷酸尾但有一个闭锁结构，5’端有一个帽子结构。RNA1和RNA2分别编码三个和四个开放阅读框[9]。Olivier V在2002年提交了两个基因序列 CBPV-B-441（EU122231） 和 CBPV A-79P（EU122229），两个序列长度分别为3658 nt和3678 nt[9]。Philippe Blanchard扩增获得9个国家（奥地利、比利时、丹麦、法国、匈牙利、波兰、西班牙、瑞士、乌拉圭）22个蜜蜂样品中的CBPV RNA1的ORF3序列，序列号从FJ345306到FJ345327长度为1947 nt，以获得不同地区CBPV的亲缘关系[10]。Kojima在Genbank提交了日本株 CBPV RdRp区序列，序列号从 AB682795到AB682799，长度都为469 nt。吴艳艳等扩增中国地区17个蜜蜂样品的CBPV RNA1 RdRp区序列，序列号从KM036169到KM036185，长度都不超过400 bp[11]。至今为止CBPV并未被病毒国际分类委员会进行种属分类(ICTV)，只有RNA1中的ORF3区与野田病毒科和番茄矮丛病毒科同源性较高，因此推测RNA1的ORF1和ORF3编码非结构蛋白，RNA2的ORF2和ORF3编码结构蛋白[12]。CBPV RNA1中包含许多重要信息，大多数研究克隆序列较短，Genbank数据库中仅有三条全基因组序列。因此本研究通过克隆获得北京CBPV RNA1的全基因组序列，以期获得更多的病毒信息。

2 材料与方法

2.1 样本采集

在中国农业科学院蜜蜂研究所内采集有明显黑腹症状的意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera）爬蜂，采集的样品迅速放置于-80℃冰箱保存。

2.2 RNA提取

将蜜蜂样品置于1.5 ml无菌管中，用电动组织研磨器在液氮中将蜜蜂研磨成细粉状，随后加入Trizol（Invitrogen美国），之后用氯仿和异丙醇按照RNA提取操作步骤提取RNA，用TE溶解，在-20℃冰箱中保存。

2.3 反转录、PCR和克隆

按照反转录（Promega美国）试剂盒说明书合成cDNA，使用Primer 5.0依据实验要求共设计5对引物，覆盖CBPV的全长，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

克隆CBPV各个片段。PCR反应液：cDNA模板为1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，2×Es Taq Master－Mix（康为世纪中国）10 μl，无菌水7 μl。反应条件为：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃0.5～2 min（由克隆片段长度决定），共34个循环，72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒（天根中国）回收目的条带。

按照全试金克隆试剂盒说明书（全试金中国）将目的片段连接到pEASY-T1载体上，连接产物转化进Trans1-T1感受态细胞中，进行阳性克隆检测，将阳性菌株送去生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.4 CBPV RNA1全长及RdRp进化树构建

目前在GenBank上公布的CBPV RNA1全基因组序列仅有3株，名称及登录号分别为：France B-441 (EU122231)、France A-79P (EU122229)、China LN（KU950353）。将本实验中得到的序列KX168412与这3株CBPV RNA1序列构建进化树，并以以色列急性麻痹病毒IAPV（EU218534）全基因组序列作为进化树外群，用Mega6分析软件中的Clustal W程序进行多重序列对齐分析，使用邻接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重复1000次构建进化树。

在GenBank上公布的CBPV RNA1序列中能够全部覆盖RdRp区的序列共25条，使用Mega6软件分析中的Clustal W程序对这25株和本文得到的序列进行多重序列对齐分析，使用邻接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重复1000次构建进化树。

3 实验结果

3.1 CBPV基因拼接及全基因组进化树分析

使用DNAman将5段CBPV RNA1序列拼接在一起，基因总长度为3657 nt的序列，提交Genbank数据库登录号为KX168412。将 KX168412与其他三株CBPV RNA1序列共同构建进化树。结果如图1所示，括号中为各个序列的登录号。

图1 CBPV RNA1全基因组系统发育进化树

通过 NCBI中的 BLAST将本文中所获得的KX168412与全部3株CBPV RNA1基因组序列进行比对分析，结果显示China BJ（KX168412）与China LN（KU950353）相似度最高为98%，其次为France B-441 (EU122231)相似度为 96%，与 France A-79P (EU122229)相似度最低91%。

全基因组序列进化树分析结果显示，所有CBPV RNA1基因型都区别于IAPV的全基因组序列。在CBPV RNA1基因型中，进化树主要是一个大的分支，其中，France B-441(EU122231)与 France A-79P (EU122229)的同源性最高；China BJ（KX168412）与China LN（KU950353）的同源性高，在进化关系上KX168412要高于France B-441(EU122231)、France A-79P(EU122229)、China LN（KU950353）。

3.2 CBPV RNA1 BJ株全基因结构及RdRp区进化分析

使用DNAman预测CBPV RNA1的ORF区，经预测，China BJ(KX168412)含有三个ORF区域，包括ORF1（19-2575）、ORF2（32-887）、ORF3（1643-3587）。

使用Mega6采用邻近法，进行系统进化树分析，对已克隆并测序的China BJ(KX168412)序列的RdRp区与NCBI数据库的其他已报道25条CBPV毒株（长度为1974 nt）构建进化树。图2进化树结果显示，有四个主要的集群，第一个集群包括一个法国株序列，两个瑞士株序列和所有的波兰株、奥地利株、丹麦株和匈牙利株；第二个集群包括两个乌拉圭株；第三个集群包括三个法国株和一个瑞士株、一个乌拉圭株、两个中国株序列；第四个集群包括法国株、西班牙株和比利时株。本文 得 到 的 China BJ（KX168412） 与 China LN（KU950353）的同源性最高，其次与France B-441、Switzerland R3 C10和Uruguay 6-M同源性较为相近。

图2 不同国家CBPV RNA1 RdRp区系统发育进化树

4 讨论

NCBI最长的CBPV RNA1基因序列是法国株，其序列号是EU122229，长度为3674 nt，比China BJ (KX168412)长17 nt[9]。经Blast比对，本文中所得到RNA1的序列与法国株（EU122229）序列的同源性达到98%。

RdRd是病毒复制的关键酶，对于病毒的传播和表达具有重要意义。Olivier V在2008年推测RNA1的ORF3氨基酸序列可能编码RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)区域[9]。经过比对发现我们克隆所得到的ORF3区与多个病毒的RdRd区高度相似。Olivier V的分析表明CBPV法国株介于番茄丛矮病毒科和野田村病毒科之间，但并不属于任何病毒科。因此选择ORF3区与其他国家CBPV病毒株进行进化树分析，以期获得更多关于CBPV分类的信息。

用 ORF Finder对 GenBank上其他 3株 CBPV RNA1全基因组序列进行分析，预测开放阅读框结果显示四株序列都含有3个ORF区。其中France B-441 (EU122231)、France A-79P(EU122229)和 China BJ (KX168412)三条序列的三个ORF区所含氨基酸数目相等，分别是852（ORF1）、285（ORF2）、648（ORF3）个氨基酸，而China LN（KU950353）序列的ORF1区含有784个氨基酸，比上述三株序列中的ORF1区少68个氨基酸。

进化分析结果显示乌拉圭株、瑞士株和法国株出现在多个集群中，没有明显的地域差异。第一集群中的CBPV RdRp序列主要集中在欧洲北部和东部；第二个集群主要集中在南美洲；第四个分支主要包括欧洲的南部和西部；第三个集群包括法国株、瑞士株、乌拉圭株和两个中国株序列，其中两个中国株序列聚为同一类，同源性较为相近，属亚洲区域，但是从整体上看这一分支中的CBPV并无明显地域差异，可能与频繁的商业交换或者病毒变异有关。另外法国株序列出现在三个分支中，出现比例明显高于其它地区CBPV株。因此可能需要更多的CBPV RdRp序列才能得到更详细和精确的地域差异。

[1]Gallai N,Salles J M,Settele J,et al.Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline [J].Ecol Econ,2009,68(3):810-821.

[2]Calderone N W.Insect pollinated crops,insect pollinators and US agriculture:trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009[J].Plos one,2012,7(5):e37235.

[3]Leonhardt S D,Gallai N,Alejandro Garibaldi L,et al.Economic gain,stability of pollination and bee diversity decrease from southern to northern Europe[J].Basic Appl Ecol,2013,14(6):461-471.

[4]Benjamin A,McCallum B.A World Without Bees[M].Guardian Books,2008.

[5]Ratnieks F L W,Carreck N L.Carity on honey bee collapse[J]? Science,2010,327(5962):152-153.

[6]Bailey L,Gibbs A J,Woods R D.The purification and properties of chronic bee-paralysis virus[J].Journal of General Virology, 1968,2(2):251-260.

[7]Ribière M,Lallemand P,Iscache A L,et al.Spread of infectious chronic bee paralysis virus by honeybee(Apis mellifera L.)feces[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(23):7711-7716.

[8]Bailey L,Gibbs A J,Woods RD.The purification and properties of chronic bee-paralysis virus[J].Journal of General Virology,1968, 2(2):251-260.http://dx.doi.org/10.1099/0022-1317-2-2-251.

[9]Olivier V,Blanchard P,Chaouch S,et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of chronic bee paralysis virus,a honey bee virus[J].Virus Research,2008,132(1-2):59-68.

[10]Blanchard P,Schurr F,Olivier V,et al.Phylogenetic analysis of the RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)and a predicted structural protein(pSP)of the Chronic bee paralysis virus(CBPV) isolate from various geographic regions[J].Virus Research,2009, 144(1-2):334-338.

[11]Wu YY,Jia HR,Wang Q,et al.Multiple virus infections and the characteristics of chronic bee paralysis virus in diseased honey bees(Apis Mellifera L.)in China[J].Journal of Apicultural Science, 2015,59(2):95-106.

[12]Ribière M,Olivier V,Blanchard P.Chronic bee paralysis:a disease and a virus like no other[J].Journal of Invertebrate Pathology,2010,103(Suppl.1):S120-S131.

Clone and Phylogenetic Analysis of Chronic Bee Paralysis Virus China RNA1 Sequence

Li Beibei,Hou Chunsheng,Diao Qingyun
(Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093)

Chronic bee paralysis virus is a contagious disease of adult honeybees,and diseased bee displayed several neurological symptoms such as trembling,crawling.And it can induce two kinds of significant different symptoms,black bright hairless or bloated abdomen.The pathogen of this disease is Chronic bee paralysis virus(CBPV), and RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)plays a vital role in the pathogenesis for the CBPV and positioned at the RNA 1 segment of CBPV genome.In order to better understand the mechanism of CBPV,we cloned the full genome of RNA 1 of CBPV and made a phylogenetic analysis on that.These results provided the fundamental data for studying the infection characterization of CBPV.

Chronic bee paralysis virus;phylogenetic analysis;RNA-dependent RNA polymerase;evolution characteristics

中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2017-IAR）

李贝贝（1991-），女，硕士研究生，研究方向为蜜蜂病虫害，E-mail：15600928925@163.com

刁青云，女，研究员，从事蜜蜂病害研究工作，E-mail:dqyun1@126.com