普鲁士蓝@石墨烯-壳聚糖纳米复合物用于构建microRNA电化学传感器的研究

苏会岚，李德长，张瑞林，梅 浩，汤 科

(成都医学院 公共卫生系， 四川 成都 610500)

普鲁士蓝@石墨烯-壳聚糖纳米复合物用于构建microRNA电化学传感器的研究

苏会岚*，李德长，张瑞林，梅 浩，汤 科

(成都医学院 公共卫生系， 四川 成都 610500)

制备了基于普鲁士蓝(PB)、石墨烯(GN)、壳聚糖(Chi)的纳米复合物(PB@GN-Chi)，并将其修饰在玻碳电极表面制得microRNA电化学传感器。实验发现，GN可有效提高敏感膜的导电性能和比表面积，增强PB在电极表面的稳定性和传感器的重现性。通过戊二醛的交联作用，将氨基化的捕获探针(ssDNA)固载在PB@GN-Chi修饰的电极表面，并用于miR-21的检测。以透射电子显微镜对纳米复合物的形态进行表征，采用循环伏安法、示差脉冲伏安法对传感器的电化学特性进行研究。实验结果表明，该传感器具有良好的稳定性和重现性，在2.8～2.8×104pmol/L浓度范围内，响应电流与miR-21浓度的对数呈线性关系，检出限为0.87 pmol/L，可用于miR-21的检测。

电化学生物传感器；普鲁士蓝；石墨烯；纳米复合物；microRNA

世界卫生组织最新发布的《世界癌症报告》指出：2012年新增1 400万癌症病例中，肺癌的发病率和致死率均居首位，缺少早期诊断是主要原因之一，大部分肺癌患者被确诊时已是中晚期。MicroRNAs(miRNAs，miRs)是一类内源性非编码小分子RNA，长度约19～25个核苷酸，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，是当前研究的热点之一。近期研究发现，正常肺组织和肺癌组织的miRNA表达模式有明显差异，且体现在实体肿瘤和患者血清中。Yanaihara和Wang等[1-2]研究发现，非小细胞肺癌(NSCLC)病人血清中miR-21水平显著升高，提示miRNA-21可作为肺癌早期诊断的分子标志物。

miRNA家族成员间有高度保守性，同时具有序列短、丰度低、稳定性差等特点，导致检测难度较高。目前，miRNA的定量检测多采用qRT-PCR、Northern杂交、微阵列芯片等技术，但分析效率不高、检测成本高，较难普及到常规筛查中[3-5]。为实现快速、灵敏、低成本的检测，电化学生物分析技术用于miRNA检测得到了关注和发展[6-9]。Gao等[10]利用miRNA为模板结合Os(dmpy)2(IN)Cl+实现了对miRNA的检测。为了增加检测灵敏度，一些信号增强策略也纷纷用于miRNA传感器的构建，如Kilic等[11]将酶催化放大策略引入miRNA电化学传感器的构建中，Wu等[12]利用目标物循环级联放大策略获得增强的电信号，均显示了较高的灵敏度。

纳米材料因具有良好的电化学特性而应用于miRNAs 电化学传感器的构建。近年来的研究表明，石墨烯(GN)具有强导电性(103～104S/m)、高比表面积(2 630 m2/g)、高韧性等特点，是至今发现的最薄及强度最高的材料[13-15]。同时，基于石墨烯的复合纳米材料因其协同效应也引起了广泛的研究[16-17]。

普鲁士蓝(Prussian blue，PB)具有良好的电活性和电催化活性，已作为一种电活性物质被广泛使用。由于PB在电极表面易渗漏，为了提高PB的稳定性，有研究者提出将PB和碳纳米管及石墨烯等材料结合制备纳米复合物，在提高PB稳定性的同时可获得优良的电化学特性[18-20]。PB的制备通常是将Fe3+与[Fe(CN)6]4-混合或将Fe2+与[Fe(CN)6]3-混合，其合成速度快，产物不易控制，导致传感器的重现性不好[21]。近期研究发现，GN可以减缓PB纳米粒子形成的速度，通过控制反应条件可获得较稳定的PB-GN 纳米复合物，提高传感器的稳定性和重现性。

基于此，本研究在GN表面合成PB，结合壳聚糖(Chi)良好的成膜性合成了一种PB@GN-Chi纳米复合物，并将其修饰在玻碳电极表面。研究表明，GN可增大电极的比表面积，提高Chi膜的导电性，同时可有效提高PB的固载量和稳定性。通过戊二醛(GA)的交联作用，将捕获探针(ssDNA，Capture probe，Cp)固载在电极表面，采用己硫醇(HT)封闭，制得的miRNA 生物传感器显示了较高的灵敏度及良好的稳定性和重现性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

羧基功能化石墨烯(GN，2.0 mg/mL)购于南京先丰纳米材料科技有限公司；壳聚糖(Chi)、凝血酶适体购于上海未来实业有限公司；寡核苷酸(miR-21：5’-CAA CAC CAG UCG AUG GGC UGU-3’，捕获探针ssRNA：5’-SH ACA GCC CAU CGA CUG GUG UUG-3’，miR-155：5’-TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT-3’)购于宝生物工程(大连)有限公司，α-氧化铝抛光粉购于阿依恒晟科技发展有限公司，其他化学试剂均为分析纯。

电化学测试采用三电极系统:玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，EC6800电化学工作站(上海恒平科学仪器公司)。pHS-3C型酸度计(上海大众仪器公司)，H-7500透射电子显微镜(日本 Hitachi Instrument 公司)。

1.2 PB@GN-Chi纳米复合物的制备

将GN溶液(1.0 mg/mL)均匀分散在Chi溶液(1.0 mg/mL)中，搅拌1.5 h。将K3Fe(CN)6(6.4 mg)和氯化钾(29.6 mg)加至上述溶液中，调节溶液的pH值为1.5，加入FeCl2·4H2O(4.8 mg)并持续搅拌24 h。将此溶液用超纯水洗涤3次，即得PB@GN-Chi纳米复合物，低温冷藏保存。同时采用超声合成法制备了上述复合物开展对照试验，即在超声条件下，将FeCl2·4H2O，K3Fe(CN)6和KCl溶液混合，调至pH 1.5。1 h后，加入1.0 mg/mL GN-Chi溶液，继续超声12 h，离心洗涤3次，即得PB/GN-Chi。

图2 GN(左)和PB@GN-Chi纳米复合物(右)的透射电镜表征图Fig.2 TEM images of GN(left) and PB@GN-Chi composite(right)

图3 不同修饰电极的DPV表征图Fig.3 DPV curves of different modified electrodesa.PB@GN-Chi;b.GA/PB@GN-Chi;c.Cp/GA/PB@ GN-Chi;d.HT/Cp/GA/PB@GN-Chi;e.miR-21/ HT/Cp/GA/PB@GN-Chi

1.3 miRNA电化学传感器的制备

miRNA电化学传感器的制备如图1所示。依次用1.0，0.3，0.50 μm的氧化铝粉于麂皮上将玻碳电极打磨抛光，再用无水乙醇和超纯水反复超声清洗，晾干后滴加10 μL PB@GN-Chi纳米复合物溶液于电极表面，晾干后在GA溶液中浸泡30 min，与捕获探针在4 ℃下反应6 h，HT封闭，即制得miRNA电化学传感器。

2 结果与讨论

2.1 电化学免疫传感器的制备及检测原理

本研究提出的miRNA电化学传感器是基于在玻碳电极表面自组装PB@GN-Chi 纳米复合物，并通过GA进一步固载捕获探针(ssRNA)而制得。利用壳聚糖良好的成膜性和丰富的氨基以及石墨烯的强导电性和大的比表面积，可有效提高敏感膜的导电能力和PB固载量，从而提高免疫传感器的灵敏度。该传感器通过PB电化学信号的改变来指示待测miRNA的含量。

2.2 PB@GN-Chi纳米复合物的表征

采用透射电子显微镜(TEM)对纳米复合物进行表征(图2)，从图中可以看到，GN均匀分散在Chi中，PB纳米颗粒修饰在GN表面，提示PB@GN-Chi纳米复合物已被成功合成。基于该复合物修饰的电极有以下特点：①PB可呈现1对准可逆的氧化还原峰，指示电信号变化；②通过原位合成法将PB固载在GN上，可提高PB的稳定性，有效解决了测试时PB易脱落的问题；③GN具有大的比表面积和强的导电性能，可有效提高敏感膜的导电性能；④ Chi可提供大量的氨基进一步结合其它功能分子。因此，基于该复合物的电化学传感器可望具有高的灵敏度和稳定性。

2.3 miRNA电化学传感器的电化学表征

采用DPV对电极的修饰过程进行表征，其结果如图3所示。图3曲线a为PB@GN-Chi修饰电极的DPV表征图，可观察到1个明显的电流峰，为电活性物质PB的特征峰。从曲线b可以看出，进一步修饰戊二醛的电极响应信号稍有降低。氨基修饰捕获探针可通过戊二醛的交联作用牢固地结合在电极表面，导致电流信号的进一步降低(曲线c)。电极表面的非特异性吸附位点采用HT进行封闭，捕获探针可通过碱基互补配位特异性识别miR-21。由于HT和miR-21的电化学惰性，图3中曲线d和e的电极响应信号逐步降低。电化学表征结果表明，该miRNA电化学传感器得以成功制备。另外，本研究还对比了PB@GN-Chi和PB/Chi修饰电极的响应信号，结果显示，PB@GN-Chi修饰电极的峰电流较PB/Chi修饰电极高73.74 μA ，说明GN的掺杂可明显增大电流响应信号。

2.4 不同扫速下修饰电极的电化学表征

考察了修饰电极在不同扫速下(50～300 mV/s)的循环伏安表征图(图4)。从图中可以看出，氧化还原峰电流均随扫速的增加而增加，且峰电流与扫速成正比，其线性方程分别为y=40.267 73+0.112 98x(r=0.976 3)，y=-1.672 33-0.175 31x(r=0.977 5)，表明该电极过程受表面控制。

图4 修饰电极在不同扫速下的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammetric curves of the modified electrode in different scan rates scan rate(a-f)：50，100，150，200，250，300 mV/s；insert: relationship between redox peak current and scan rate

图5 PB@GN-Chi和PB/GN-Chi修饰电极在不同测试次数下的DPV表征图Fig.5 DPV curves of the PB@GN-Chi prepared by in situ synthesis method and PB/GN-Chi ultrasonic synthesis method a,c:1st test;b,d:20th test

2.5 生物识别作用时间的优化

miRNA与捕获探针的特异性识别时间是影响检测的重要因素。本研究测定了miRNA电化学传感器与miR-21反应不同时间时的电化学信号。结果显示，随着反应时间的增加，峰电流逐渐降低，当反应时间为30 min时，继续增大反应时间，峰电流基本不变，说明miR-21在此电极表面与捕获探针完全反应需要30 min，故选择30 min为本实验的生物识别反应时间。

2.6 miRNA传感器的性能研究

2.6.1 传感器对不同浓度miR-21的响应 在最优实验条件下，将制备好的miRNA传感器与不同浓度的miR-21溶液结合以考察该传感器的电流响应特性。结果显示，随着miR-21浓度的增加，其氧化还原峰电流逐渐减小。待测物的电流响应与miR-21浓度的对数在2.8～2.8×104pmol/L范围内成正比，检出限(S/N=3)为0.87 pmol/L。

2.6.2 miRNA传感器的稳定性 对miRNA传感器(PB@GN-Chi)的稳定性进行研究。将制备好的miRNA传感器采用DPV连续测定20次，其结果如图5所示。图中曲线c和d分别为第1次和第20次扫描的DPV表征图，可以看出其峰电流基本无变化。同时制备了基于PB/GN-Chi纳米复合物的miRNA传感器进行对照研究，采用同样的方法对该传感器进行了稳定性测试，图中曲线a和b分别为该传感器第1次和第20次扫描的DPV表征图，可以看到曲线b较曲线a的电流有明显降低，说明本研究提出的PB@GN-Chi纳米复合物制备方法可以有效提高敏感膜在电极表面的稳定性，提高该传感器的稳定性。另外，将传感器与miR-21识别完成后，储存于冰箱，每7 d测试1次，连续测试4次，结果显示其响应电流无明显变化，说明该传感器的长期稳定性较好。

2.6.3 miRNA传感器的重现性与选择性 为了考察该传感器的重现性，将平行制备的5支电极插入相同浓度的miRNA溶液中。结果显示，5支电极测量信号的相对标准偏差(RSD，n=5)为0.93%，提示该传感器具有良好的重现性。同时，将此miRNA传感器用于560 pmol/L miR-21及混合溶液(5 nmol/L凝血酶适体，5 nmol/L miR-155，560 pmol/L miR-21)的测定，混合溶液和miR-21的电流响应结果差(ΔI)为0.02 μA，证明该传感器的选择性良好。

2.6.4 miRNA传感器回收率的测定 采用标准加入法测定了miRNA传感器的回收率。分别将28，56，280，560 pmol/L 的miR-21加至模拟人体血清环境的溶液中，用miRNA传感器分别进行检测，结果显示，传感器的回收率分别为103.1%，100.0%，99.0%，96.8%。表明该传感器具有较好的准确性，可用于临床血清的检测。

3 结 论

GN具有大的比表面积和良好的导电性能，可在增强敏感膜导电性的同时提高电活性物质PB的固载量。本文在GN表面合成了PB，结合壳聚糖制备了PB@GN-Chi纳米复合物，并将其滴涂在玻碳电极表面成功构建了miRNA电化学传感器，实现了对miR-21的快速检测。结果表明，该传感器具有较高的稳定性和灵敏度，同时具有良好的选择性和准确性。

[1] Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,Seike M,Kumamoto K,Yi M,Stephens R M,Okamoto A,Yokata J,Tanaka T,Calin G A,Liu C G,Croce C M,Harris C C.CancerCell,2006,9(3)：189-198.

[2] Wang Z X,Bian H B,Wang J R,Cheng Z X,Wang K M,De W,J.Surg.Oncd.,2011,104(7)：847-851

[3] Donnem T，Eklo K，Berg T，Sorbye S W，Lonvik K，Saad S A，Andersen S，Stenvold H，Bremnes R M，Busund L T.J.Transl.Med.，2011，9：6-10.

[4] Sunitha T，Xu H，Chen J，Kwaku B，Qiu W，Zhao J X，Liu G D.Anal.Sci.，2016，32(6)：617-622.

[5] Nelson P T，Baldwin D A，Scearce L M，Oberholtzer J C，Tobias J W，Mourelatos Z.Nat.Methods，2004，1(2)：155-161.

[6] Xiang G M，Jiang D N，Luo F K，Liu F，Liu L L.Sens.ActuatorsB，2014，159:515-519.

[7] Yin B C，Liu Y Q，Ye B C.J.Am.Chem.Soc.，2012，134：5064-5067.

[8] Hong C Y，Chen X，Liu T，Li J，Yang H H，Chen J H，Chen G N.Biosens.Bioelectron.，2013，50：132-136.

[9] Zhang P，Wu X Y，Yuan R，Chai Y Q.Anal.Chem.，2015，87：3202-3207.

[10] Gao Z Q，Yu Y H.Sens.ActuatorsB，2007，121：552-559.

[11] Kilic T，Topkaya S N，Ariksoysal D O，Ozsoz M，Ballar P，Erac Y，Gozen O.Biosens.Bioelectron.，2012，38：195-201.

[12] Wu X Y，Chai Y Q，Zhang P，Yuan R.Appl.Mater.Interfaces，2015，7(1)：713-720.

[13] Bunch J S，Zande A M V D，Verbridge S S，Frank I W，Tanenbaum D M，Parpia J M，Craighead H G，McEuen P L.Science，2007，315(5811)：490-493.

[14] Rao C N R，Ood A K，Subrahmanyam K S，Govindaraj A.Angew.Chem.Int.Ed.，2009，48:7752-7777.

[15] Yu H，Gao X L，Xu N，Chen X X，Feng X，Jin J.J.Instrum.Anal.(于浩，高小玲，徐娜，陈小霞，冯晓，金君.分析测试学报)，2016，35(11)：1416-1421.

[16] Hu T，Zhang L，Wen W，Zhang X H，Wang S F.Biosens.Bioelectron.，2016，77：451-456.

[17] Yang M H，Jeong J M，Lee K G，Kin D H，Lee S J，Choi B G.Biosens.Bioelectron.，2017，89：612-619.

[18] Wang L，Tricard S，Yue P，Zhao J，Fang J，Shen W.Biosens.Bioelectron.，2016，77:1112-1118.

[19] Wang H N，Qi Y，Sun Z，Feng T T，Hong C L.J.Instrum.Anal.(王海宁，齐誉，孙昭，冯涛涛，洪成林.分析测试学报)，2016，35(10)：1289-1294.

[20] Jin E，Lu X F，Cui L L，Chao D M，Wang C.Electrochim.Acta，2010,55：7230-7234.

[21] Lai G，Zhang H，Yu A，Ju H.Biosens.Bioelectron.，2015，74：660-665.

Development of microRNA Electrochemical Biosensor Based on Prussian Blue@Graphene-Chitosan Nanocomposite Prepared by in situ Deposition

SU Hui-lan*，LI De-zhang，ZHANG Rui-lin，MEI Hao，TANG Ke

(Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China)

A microRNA(miR，miRNA) electrochemical biosensor was proposed in the present research.Firstly，graphene(GN) was dispersed in the chitosan(Chi) solution to promote the conductivity of chitosan film.Then，prussian blue(PB) was in situ deposited on GN to obtain the PB@GN-Chi nanocomposite.The obtained nanocomposites were modified on the surface of electrode.Compared with the PB@GN-Chi prepared by ultrasonic method，the prepared composite could effectively prevent PB leaking into detection solution and display a prominent stability when modified on the electrode.The capture probe was subsequently modified by amino group and covalently linked to the modified electrode via glutaraldehyde.After blocked by hexanethiol，the miRNA biosensor was successfully prepared.The prepared PB@GN-Chi nanocomposite was observed with transmission electron microscope，and the electrochemical characteristics of the miRNA biosensor were investigated by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry.Under the optimal conditions，the biosensor displayed a linear relationship between current response and the logarithm of concentration of miR-21 in the range of 2.8-2.8×104pmol/L.The detection limit was calculated to be 0.87 pmol/L.The prepared biosensor owns good stability and repeatability，and could be employed to detect miR-21 in human serum sample.

electrochemical biosensor；prussian blue；graphene；nanocomposite；microRNA

2016-12-27；

2017-01-20

国家自然科学基金资助项目(81401757)；发育与再生四川省重点实验室项目(SYS16-004)；成都医学院科研创新团队(CYTD16-03)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.011

O657.1；Q522

A

1004-4957(2017)05-0645-05

*通讯作者：苏会岚，博士，讲师，研究方向：生物分析化学，Tel:028-62739576，E-mail :suhuilan1986@163.com