SNS314对乳腺癌细胞T47D生长的影响

张 月，王耀一，武雪亮，周海丰，梁晚平(河北北方学院附属第一医院乳腺外科,张家口 075000;通讯作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

SNS314对乳腺癌细胞T47D生长的影响

张 月，王耀一，武雪亮，周海丰，梁晚平*
(河北北方学院附属第一医院乳腺外科,张家口 075000;*通讯作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

目的 探讨SNS314对体外培养人乳腺癌T47D细胞生长的影响。 方法 用0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314分别处理T47D细胞，采用MTT法评价SNS314对人类乳腺癌细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期。Western blot检测总AuroraA(T-Aurora A)、磷酸化Aurora A(p-Aurora A)、磷酸化组蛋白(p-Histone H3)、总组蛋白(T-Histone H3)和凋亡相关蛋白以及Cyclin B1表达水平的变化。免疫荧光检测多核细胞形成，Annexin Ⅴ-FITC与PI双染检测细胞凋亡率。 结果 不同浓度的SNS314分别处理T47D细胞24 h、48 h，T47D增殖明显抑制，IC50分别为(2.684±0.429)μmol/L和(0.309±0.510)μmol/L；流式细胞术显示随着浓度增加，G2/M期细胞由(21.40±0.53)%升高至(93.73±0.06)%，G2/M期阻滞呈剂量依赖性；Western blot显示SNS413处理后p-Aurora A、p-Histone H3蛋白表达受到抑制，Cyclin B1的表达下调，Bcl-2表达降低，促进PARP蛋白剪切及增强Bax表达。免疫荧光检测到多核细胞，Annexin Ⅴ-FITC与PI双染检测显示细胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，与SNS314 0 μmol/L组比较，凋亡率显著增加(P<0.05)。 结论 SNS314抑制乳腺癌细胞T47D的增殖、诱导凋亡，且呈剂量依赖性。

乳腺癌； SNS314； Aurora激酶； 细胞增殖； 细胞凋亡

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，对女性的健康与生命安全构成严重的威胁，据我国疾病预防控制中心流行病学调查乳腺癌位居我国女性恶性肿瘤第一位[1]。研究表明Aurora 激酶与乳腺癌的关系比较密切，乳腺癌中Aurora A和Aurora B的表达是比较常见的，表达率为26%-94%，Aurora激酶已经作为分子靶点表现了抗肿瘤能力，Aurora激酶家族为丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期调控中起着重要的作用，Aurora激酶的过表达会干扰有丝分裂检查点的功能，导致遗传的不稳定性和诱发肿瘤的增长。SNS314作为小分子Aurora激酶抑制剂，可同时抑制Aurora A、B，有研究表明SNS314具有抑制细胞增殖的效应，抑制组蛋白H3的磷酸化、阻止细胞周期进程，使细胞失去生存能力，诱导细胞凋亡的作用，但其对乳腺癌T47D细胞的作用研究不多。本研究的实验主要检测SNS314抑制人乳腺癌T47D细胞的增殖效应，诱导凋亡并且初步探讨与其相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人乳腺癌细胞株T47D由河北北方学院中心实验室提供；SNS314购自美国Selleck公司；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；BCA蛋白分析试剂盒购自美国Pierce公司；DAPI染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司； p-Aurora A、p-Histone H3、Aurora A、Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax一抗购于美国Cell Signaling Technology公司；二抗购自Santa Cruz 公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡试剂盒购于BD公司(美国)。

1.2 细胞培养及处理

对照组T47D细胞株常规培养于RPMI 1640培养液中，内加10%胎牛血清、人青霉素(浓度100 U/ml)和链霉素(浓度100 μg/ml)，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,处理组分别给予SNS314 0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L处理。

1.3 MTT法检测细胞生存率

取对数生长期的T47D细胞以1×104个/ml细胞浓度接种于 96 孔板内，每孔 0.1 ml。取不同的浓度SNS314(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)处理T47D细胞24,48 h ,每孔加入20 μl浓度为 5 g/L的 MTT，继续培养 4 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜 200 μl震荡 10 min充分溶解显色，酶标仪波长 570 nm处检测吸光度 (A值) ，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照孔A值-加药孔A值)/对照孔A值×100%。

1.4 Western blot检测 Aurora激酶及凋亡相关蛋白的表达

将实验组(0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314)和对照组(0 μmol/L)细胞的蛋白样品30 μg分别行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，37 mA恒流1 h将蛋白电转移至PVDF膜上，含5%牛奶TBST封闭纤维素膜0.5 h，加入一抗4 ℃过夜，TBST洗涤 3次，然后与二抗(辣根过氧化物酶标记)室温孵育1 h后TBST洗涤3次， ECL显影，曝光。检测Aurora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax。抗Aurora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax，抗体稀释比例为1 ∶1 000，β- actin抗体稀释比例为1 ∶10 000，二抗稀释比例1 ∶10 000 。

1.5 流式细胞术分析细胞周期改变

分别用对照组(未处理)、抑制剂组(SNS3140.001,0.01,0.1,1,10μmol/L)处理T47D 24 h后，收集细胞并调整细胞数至1×106个/ml，用冷PBS洗涤细胞，离心1 000 r/min，5 min两次，预冷的95%乙醇固定，离心乙醇固定的细胞，弃去乙醇，加入PI(50 μg/ml)与RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用 15 min后，在流式细胞仪上机分析，检测1×104个细胞，并用multicycle软件进行细胞周期的分析。

1.6 免疫荧光观察核的改变

对细胞进行消化、计数，调整细胞密度至103/ml，把预先处理的无菌玻片放入12孔板中，将以上细胞悬液滴入每孔(保证每孔为2 ml)，放入37 ℃、5% CO2孵箱中培养过夜使其贴壁。给予SNS314 1 μmol/L处理48 h后，将培养液弃去，用预冷的1×PBS洗3次(5 min/次)，经4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI着色5-10 min，1×PBS洗3次后封片，在荧光显微镜下观察，共聚焦显微镜下采图。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

分别用对照组(未处理)、加药组SNS314 0.1,1,10 μmol/L分别处理T47D 24 h后，收集细胞，并调整的细胞数至1×106个/ml，用冷PBS洗涤细胞两次。加入Binding 缓冲液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室温避光孵育15 min后加入Binding 缓冲液400 μl细胞悬液中加入孵育20-30 min。流式细胞仪FACScan测定，经计算机软件处理计算凋亡细胞百分率。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 SNS314抑制细胞生长

MTT法显示随着SNS314浓度和作用时间的增加呈现明显的量效关系，抑制率曲线呈上升的趋势,与对照组(0 μmol/L)比较，差异有统计学意义(P﹤0.05)，24,48 h的IC50值分别为(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L，10 μmol/L SNS314 作用于T47D细胞24 h抑制率为(65.78±0.01)%,作用48 h后抑制率可达(83.19±0.01)%(见图1)。

与对照组(0 μmol/L)比较，*P<0.05图1 MTT检测不同浓度不同时间SNS314对T47D细胞抑制率曲线 (n=3)Figure 1 Effect of different concentrations of SNS314 on proliferation of T47D cells (n=3)

2.2 SNS314可以导致G2/M期阻滞流式细胞术显示SNS314浓度从0 μmol/L到

10 μmol/L,显示G0/G1期细胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期细胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期细胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%(见表1)，实验组与对照组(0 μmol/L)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 SNS314作用于T47D细胞24 h对细胞周期的影响 (%)

Table 1 Effect of SNS314 for 24 h on cell cycle of T47D cells (%)

SNS314的浓度(μmol/L)G0/G1SG2/M0 49．30±0．6629．30±0．3022．40±0．530．00136．00±0．4628．77±0．3134．23±0．670．01 31．50±0．15∗20．40±0．82∗48．10±0．16∗0．1 16．33±0．54∗5．63±0．41∗79．04±0．75∗1 8．63±0．25∗4．26±0．31∗87．11±0．35∗10 5．13±0．21∗1．12±0．11∗93．75±0．06∗

2.3 SNS314对Aurora A、组蛋白H3磷酸化水平的影响

随着SNS314浓度的增加，Aurora A和Histone H3总蛋白表达没有明显变化，而Aurora A、组蛋白H3磷酸化水平的表达逐渐减弱，CyclinB1的蛋白表达减少,呈现明显的递减趋势(见图2)。

1.对照组(0 μmol/L);2. 0.001 μmol/L SNS314;3. 0.01 μmol/L SNS314;3. 0.1 μmol/L SNS 314; 4. 1 μmol/L SNS314;5.10 μmol/L SNS314图2 Western blot检测SNS314作用于T47D细胞24 h后磷酸化Aurora激酶和磷酸化组蛋白以及凋亡相关蛋白表达的变化Figure 2 The expression of phosphorate Aurora A,phosphorate Histone H3 and apoptosis-related protein after treated with SNS314 for 24 h by Western blot

2.4 SNS314对T47D细胞细胞核的影响

对照组 SNS314 0 μmol/L作用于T47D细胞核没有改变，当1 μmol/LSNS314作用于T47D细胞可见细胞核形态改变，出现核的分叶现象，多核细胞的产生，最终形成多倍体细胞，影响胞质的正常分裂，细胞最终走向凋亡(见图3)。

A.对照组 B.1 μmol/L SNS314 图3 SNS314作用于T47D细胞48 h对T47D细胞核的影响Figure 3 Effect of SNS314 on cell nucleus of T47D cells after treatment for 48 h

2.5 SNS314对凋亡的影响

随着SNS314浓度的增加，PARP的剪切带和Bax的表达水平增加，Bcl-2蛋白的表达减少(见图2)。Annexin Ⅴ-FITC与PI双染显示SNS314 0，0.1，1，10 μmol/L作用T47D细胞24 h凋亡率分别为(2.07±0.21)%、(7.83±0.31)%、(10.03±0.31)%、(32.47±2.65)%，随着药物浓度的增加，凋亡率增加(见图4)。

A.对照组 B.SNS314 0.1 μmol/L C.SNS314 1 μmol/L D.SNS314 10 μmol/L图4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测SNS314对细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of SNS314 on apoptosis of T47D cells by Annexin Ⅴ-FITC/PI

3 讨论

Aurora A、B、C是Aurora激酶家族中的3个成员，主要在调节中心体成熟、有丝分裂纺锤体形成、胞质分裂中占有重要的地位。它们在多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中过表达[2]，其中在94%浸润性乳腺癌中过表达Aurora A,而在正常组织中低表达，Aurora A可作为乳腺癌独立的预后因素[3]，Aurora A主要在G2/M期达到高峰，调节细胞周期中G2/M转换，是调节M期进展的关键因子[4]。Aurora B调节有丝分裂的关键步骤：Aurora B使组蛋白H3磷酸化[5]。Aurora B作为染色体信使复合物，保证染色体的分离和线性结构，在细胞周期进展和完成有丝分裂的过程中扮有重要角色。

过去十几年中，药物领域主要研究Aurora A与人类肿瘤的关系,如何抑制Aurora A达到抑制肿瘤的效果，对于Aurora B的研究甚少，Aurora B受抑制后核内发生复制，多倍体细胞聚集，最终导致有丝分裂失败和细胞凋亡，研究表明细胞增殖至关重要的是Aurora B而不是Aurora A。

Arbitrario等[6]研究表明SNS314是ATP竞争性结合性小分子Aurora激酶抑制剂，可抑制细胞的增殖，抑制组蛋白H3的磷酸化，细胞出现多倍体现象，胞质分裂失败。Vander Porten等[7]发现SNS314在结肠癌细胞中有抑制肿瘤细胞增殖、阻断微管形成的作用，从而发生细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。本研究以人乳腺癌T47D细胞为研究对象，检测SNS314对T47D细胞的增殖抑制以及对细胞凋亡的影响，对其分子机制进行了初步探讨。MTT显示10 μmol/L SNS314作用于T47D细胞24，48 h抑制率分别为(65.78±0.01)%、(83.19±0.01)%，IC50分别为(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L。流式细胞术显示细胞周期在加药组出现了明显的G2/M期阻滞，G0/G1期细胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期细胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期细胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%，实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。本实验结果与文献报道相一致[8]。

Aurora A转化为磷酸化Aurora A才能发挥活性，Cyclin B1是细胞周期中的一种重要的蛋白，使细胞通过G2/M期的检查点，促进细胞G2/M期的转换，它在有丝分裂中后期被降解，促进有丝分裂完成，促使细胞周期的运行[9,10]。Cyclin B1为磷酸化Aurora A的下游基因，因而干扰磷酸化的Aurora A形成会影响到G2/M细胞周期的运行，使细胞发生凋亡， Bcl-2/Bax比例是决定细胞进入凋亡与否的关键因素[11]，细胞发生凋亡后可以诱导促凋亡蛋白Bax表达增加，PARP剪切带表达增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少。本研究中Western blot结果显示磷酸化Aurora A和磷酸化组蛋白H3的表达随着浓度的增加逐渐减少。随着SNS314药物浓度的增加伴随Cyclin B1的蛋白表达量减少，这说明细胞的增殖抑制可能与下调Cyclin B1的表达，不能有效调节G2/M期细胞周期的进展，这与文献[7]报道一致。T47D细胞经过不同浓度SNS314处理后Bcl-2与Bax的表达呈相反趋势即Bax的蛋白表达量增加，Bcl-2的蛋白表达量减少，细胞进入凋亡。同时，流式细胞术Annexin-Ⅴ/PI双染显示随着SNS314浓度的增加，细胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，凋亡细胞明显增加。SNS314抑制磷酸化Aurora A的同时也抑制磷酸化组蛋白H3的表达，Western blot显示随着药物浓度的增加磷酸化H3的表达减少，免疫荧光显示1 μmol/L SNS314作用于乳腺癌T47D细胞48 h，DNA聚集，多核形成，多倍体细胞产生，胞质分裂失败，最终细胞发生凋亡。

总而言之，本实验SNS314抑制乳腺癌细胞T47D细胞增殖，发生凋亡主要两种途径：一方面抑制磷酸化AuroraA从而下调Cyclin B1的表达，另一方面抑制磷酸化组蛋白H3，干扰Aurora B功能，影响细胞的胞质分裂，使细胞发生G2/M期阻滞，形成多倍体细胞，干扰细胞周期的进程，Bcl-2的表达下降，PARP剪切带与Bax的表达增加，诱导T47D细胞发生凋亡。

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Effects of Aurora kinase inhibitor SNS314 on growth of breast cancer cells

ZHANG Yue,WANG Yaoyi,WU Xueliang,ZHOU Haifeng，LIANG Wanping*
(DepartmentofMammographySurgery,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;*Correspondingauthor,E-mail：zhangyue906@tom.com)

ObjectiveTo investigate the effects of SNS314,a new Aurora kinase inhibitor,oninvitrogrowth of T47D breast cancer cell lines.MethodsT47D cells were culturedinvitrowith different concentrations of SNS314(0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L),respectively,and the cells at logarithmic growth phase were used for this experiment.The effect of SNS314 on cell proliferation was examined by MTT assay.Cell cycle of T47D cells was determined by flow cytometry.The levels of phosphorate-Aurora A(p-Aurora A),total Aurora(T-Aurora),phosphorate-Histone H3,total Histone H3,Cyclin B1 and apoptosis relative protein expression(Bcl-2,Bax,PARP) were detected by Western blot.The variety of nucleus was observed by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells was detected by flow cytometry.ResultsDifferent concentrations of SNS314 significantly inhibited the proliferation of T47D cells after treatment for 24 h or 48 h in a dose-dependent manner,with the IC50of (2.684±0.429) μmol/L and (0.309±0.510) μmol/L.The percentage of G2/M cells was increased from (21.40±0.53)% in 0 μmol/L group to (93.73±0.06)%in 10 μmol/L group.Flow cytometry showed G2/M cells were arrested in a dose-dependent manner.Western blot showed that SNS314 inhibited dose-dependently p-Aurora A,p-Histone H3,Cyclin B1,Bcl-2,while promoted the dissection of PARP and the expression of Bax.SNS314 showed no significant effect on the expression of T-Aurora,T-Histone H3.SNS314 induced multinuclear by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells increased from (2.07±0.21)% in 0 μmol/L group to (32.47±2.65)% in 10 μmol/L group.Compared with 0 μmol/L group,the apoptosis ratio was increased in 10 μmol/L group(P<0.05).ConclusionSNS314 may inhibite the proliferation and induce the apoptosis of T47D cells in a dose-dependent manner.

breast cancer； SNS314； Aurora kinase； cell proliferation； cell apoptosis

河北省医学科学研究重点课题资助项目(ZD20140243)

张月，女，1984-10生，硕士,主治医师,E-mail:zhangyueyue906@163.com

2017-02-15

R737.9

A

1007-6611(2017)05-0436-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.007