副干酪乳杆菌HD1.7发酵酸菜与商品酸菜代谢物比较与品质评价

赵 丹，杜仁鹏，王 瑶，王琪，那 金，郭尚旭，葛菁萍,*

（1.黑龙江大学生命科学学院，微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；2.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；3.天津大学化工学院，天津 300072）

副干酪乳杆菌HD1.7发酵酸菜与商品酸菜代谢物比较与品质评价

赵 丹1,2，杜仁鹏1,3，王 瑶1，王琪1，那 金1，郭尚旭1，葛菁萍1,2,*

（1.黑龙江大学生命科学学院，微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；2.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；3.天津大学化工学院，天津 300072）

以分离自酸菜发酵液的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7为发酵剂，构建酸菜发酵微生物生态系统研究模型，利用高效液相色谱和气相色谱-质谱联用技术，分析L. paracasei HD1.7发酵酸菜、自然发酵酸菜及8 种商品酸菜中 有机酸、酸度、亚硝酸盐、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇及挥发性风味成分的差别。结果表明：不同酸菜样品中有机酸含量与酸度正相关，黑大酸菜、L. paracasei HD1.7发酵酸菜和袁滋袁味酸菜有机酸含量较高，分别为（13.21±0.13）、（13.20±0. 17）、（13.13±0.13）g/L。 此外，黑大酸菜、 L. paracasei HD1. 7发酵酸菜、边府记酸菜中不仅亚硝酸 盐含量显著低于其他供试酸菜，VC含量显著高于其他供试酸菜（P＜0.05），安全性、营养价值更高，而且风味物质含量丰富、感官品质 更优。研究结果有助于酸菜生产工艺监控和质量标准建立，对酸菜质量稳定性的提高和产业发展水平的提升具有实践指导意义；同时展现了L. paracasei HD1.7在酸菜发酵的工业生产中的应用前景。

酸菜；品质；发酵剂；副干酪乳杆菌；代谢组学；质谱

Key words: pickle Chinese cabbage; quality; starter culture; Lactobacillus paracasei; metabonomics; mass spectrometry

蔬菜自古 以来是人类赖以生存的食物资源。我国是世界上蔬菜资源最为丰富的国家[1]。白菜（Brassica pekinensis）被誉为“百菜之王”，种植广泛，营养富丰。酸菜是酸渍白菜的简称，在低浓度食盐条件下，经微生物乳酸发酵而成，是我国东北地区特色传统发酵食品[2]。据《本草纲目》记载，酸菜制作工艺至今己有430多年的历史[3]。东北酸菜起源于辽宁，之后流传到吉林和黑龙江两省。酸菜具有清酸脆爽、色泽鲜亮、香气扑鼻、开胃提神、醒酒去腻等特点，不但能增食欲、助消化，还可以降低胆固醇，促进人体对钙、铁、磷元素的吸收[4]。随着人们生活水平的提高和交通运输的便利，酸菜逐渐获得全国乃至整个亚洲地区消费者的青睐。

酸菜腌制时，白菜不需灭菌，微生物多样性丰富，浸出液代谢物组分多样，生物因素与非生物因素内部及之间的相互作用十分复杂。微生物尤其是细菌群落演替，带来代谢物组分变化，直接决定酸菜的品质和风味[5]，主要包括糖、有机酸、醇类、脂类、酮类、无机盐、含氮物质、维生素、氨基酸、芳香物质等[6]。乳酸菌利用糖类进行乳酸发酵，产生大量的有机酸，包括乳酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、丁二酸、琥珀酸及苹果酸等。这些有机酸味道醇和、刺激性小，具有开胃、解油腻等，不仅赋予酸菜柔和的酸味，还可以降低发酵系统的pH值[7-8]。此外，醇类物质赋予酸菜轻快地醇香味。乙醇、丙醇、丁醇、2,3-丁二醇和苯乙醇是乳酸代谢途径中重要的代谢产物，可以提供令人愉快的香气[9]。同时，白菜中的脂肪被分解成脂肪酸和甘油，最终转化为脂肪醇，具有水果香味[10]。

近些年来，很多学者开始关注酸菜发酵过程中风味物质的变化情况。杨利玲等[11]报道在发酵末期，加菌酸菜亚硝酸盐含量为8.73 mg/kg，自然酸菜为16.84 mg/kg，低于国家标准限度值。苏扬等[12]研究表明，泡菜液中的糖与酸呈现消长的趋势，发酵液中产生了大量的乳酸；VC的损失较少。周相玲等[13]发现自然卷心菜发酵中有机酸组成和含量发生了较大的变化，总游离氨基酸的含量降低，挥发性风味物质的种类大大增加。

代谢组学技术指利用质谱（mass spectrometry， MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技术平台，对某一细胞、器官、生物体内维持其正常生长和功能的小分子代谢物或化学分子（小于1 500 D）进行同时定量测定，现已广泛用于发酵食品的品质监控以及终产品质量鉴定[14]。Jeong等[15]利用NMR技术研究韩国水泡菜中代谢产物的变化，在发酵末期甘露醇为14.05 g/L，甘油为0.42 g/L，乙醇为0.93 g/L。为了迎合消费者对食品功能与安全的要求，研究者致力于酸菜产品的“低盐化、低糖化、保健化”转型。由于酸菜发酵过程中代谢组分多样，多数成分含量较少，不易被检测，且对其品质的监测评价尚缺乏统一的标准。虽然近些年对代谢物已有大量的研究，但是技术简单落后，与韩国、日本等国家在发酵食品的分析鉴定上存在一定的差距。因此，本研究以分离自酸菜发酵液的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7为发酵剂，构建酸菜发酵微生物生态系统研究模型，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）等先进的代谢组学技术，分析L. paracasei HD1.7发酵酸菜、自然发酵酸菜及8种商品酸菜中有机酸、酸度、亚硝酸盐、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇及挥发性风味成分的差别，并与商品酸菜比较分析。研究结果有助于酸菜工艺的监控和质量标准的建立，对酸菜质量稳定性的提高和产业发展水平的提升具有实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

发酵剂L. paracasei HD1.7，分离自自然酸菜发酵液，用于酸菜发酵，保藏于黑龙江大学微生物重点实验室。

白菜 哈尔滨哈达蔬菜批发市场；食用盐 中国盐业总公司；8 种供试商品酸菜均购自哈尔滨中央红超市学府路店，详细信息见表1。

表 1 商品酸菜Table 1 Commercial pickled Chinese cabbage tested in this study

甲氧氨基盐酸盐、吡啶、三甲基氯硅烷、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 美国Sigma公司；食品中亚硝酸盐含量测定试剂盒（编号A038） 南京建成科技有限公司；其他试剂均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

乳酸细菌培养基（MRS）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，柠檬酸铵2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.5，121℃高压蒸汽灭菌15 min。1.2 仪器与设备

50 L塑料发酵罐 哈尔滨道外生活器具批发市场；A560紫外-可见分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；LC20A型HPLC仪 岛津国际贸易上海有限公司；7890A/5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酸菜发酵

自然发酵酸菜：选取优质实心白菜，晾晒2 d后去除坏叶，用自来水清洗干净，20 kg白菜逐层放置于发酵罐中压实，用25 L 3 g/100 mL的食盐水浸泡，15～20 ℃密封静置发酵。L. paracasei HD1.7发酵酸菜：取对数生长期的L. paracasei HD1.7作为直投发酵剂，以10%（V/V）的接种量接入到自然发酵酸菜罐，菌体终浓度为7×106个/mL。发酵时间31 d。

1.3.2 酸度的测定

不同酸菜样品中酸度的测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[16]。

1.3.3 亚硝酸盐含量的测定

采用食品中亚硝酸盐测试盒测定酸菜中亚硝酸盐的含量，具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 风味物质含量测定

VC含量参照李军[17]的方法进行测定；甘露醇含量测定参照蒋华等[18]的方法；乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、甘油、乙醇、2,3-丁二醇含量利用HPLC检测；挥发性化合物由GC-MS检测，利用安捷伦数据分析工作站MSD Chemstation提取谱图信息，NIST11.5数据库鉴定化学物质。SIMCAP11.5+软件分析可视化数据，建立主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA）模型，并通过响应置换检验法验证模型是否过拟合。

1.3.5 酸菜感官评价

邀请10 名经过感官品评培训的人员组成评定小组，依据表2对10 种不同品牌的酸菜进行品评[19]。

表 2 酸菜感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of pickled Chinese cabbage

1.4 数据统计分析

每项实验均重复进行3 次，数据以±s表示。运用SPSS Statistics19软件对数据进行统计学分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 酸度与有机酸含量的比较

图 1 不同酸菜样品中有机酸含量Fig. 1 Organic acid concentrations in different pickled Chinese cabbages

如图1所示，黑大酸菜有机酸含量最高为（13.21±0.13）g/L，L. paracasei HD1.7发酵酸菜为（13.20±0.17）g/L，有机酸含量最低的为朱老六酸菜（10.63±0.25）g/L。10 种酸菜酸度范围为（6.87±0.07）～（8.18±0.06）g/L，酸度与有机酸含量正相关，其中袁滋袁味酸菜的酸度显著高于其他9 种酸菜（P＜0.05）。酸性环境能够抑制许多有害微生物的生长，保持酸菜的硬脆度，防止VC的降解[20-21]。从有机酸组成上看，在所有酸菜样品中，乳酸是含量最多的组分，占（59.02±0.54）%～（66.92±0.69）%。乳酸含量是酸菜营养程度的重要指标，不仅提供清爽可口的酸味，还具有防腐功能。L. paracasei HD1.7发酵酸菜中乳酸占有机酸总量的（66.33±1.18）%，且显著高于其他样品（P＜0.05）。柠檬酸可以为酸菜提供温和爽快、有新鲜感的感官品质，也是酸菜发酵过程中风味形成的重要参考指标。10 种酸菜中，柠檬酸占有机酸含量仅次于乳酸，黑大酸菜中柠檬酸占有机酸总量的（32.53±2.03）%，显著高于其他样品（P＜0.05）。

2.2 亚硝酸盐及VC含量的比较

图 2 不同酸菜样品中亚硝酸盐与VC含量Fig. 2 The concentration of nitrite and VC in different pickle Chinese cabbages

如图2所示，10 种酸菜中亚硝酸盐含量范围为（4.30±0.33）～（12.95±0.86）mg/kg，低于国家卫生标准20 mg/kg。其中L. paracasei HD1.7发酵酸菜亚硝酸盐含量最低为（4.3±0.33）mg/kg，其次较低的为边府记酸菜（（8.68±0.48）mg/kg）和黑大酸菜（（10.15±0.32）mg/kg）。L. paracasei HD1.7发酵酸菜VC含量最高为（392.47±3.26）mg/kg。L. paracasei HD1.7发酵酸菜、边府记酸菜和黑大酸菜均以乳酸菌为发酵剂，产生大量的乳酸等有机酸，降低硝酸盐还原酶的活性，加速亚硝酸盐的降解，减慢VC的降解速度[22-23]。

2.3 重要风味物质含量的比较

图 3 不同酸菜样品中4 种重要风味物质含量Fig. 3 The concentrations of four important flavor compounds in different pickled Chinese cabbages

酸菜样品中甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇的含量存在显著差别，没有特异性关系（图3）。甘油含量较高的为L. paracasei HD1.7发酵酸菜（（0.48±0）g/L）和边府记酸菜（0.42±0）g/L；甘露醇含量较高的为黑大酸菜（（14.57±0.29）g/L）和L. paracasei HD1.7发酵酸菜（（14.47±0.06）g/L）；乙醇含量较多的为对照组酸菜（（0.96±0）g/L）和袁滋袁味酸菜（（0.95±0.01）g/L）；黑大酸菜和L. paracasei HD1.7发酵酸菜中2,3-丁二醇的含量均为（0.018±0）g/L。这些代谢产物的含量差异与pH值及有机酸含量没有相关性。由于L. paracasei HD1.7发酵酸菜和黑大酸菜均以同型乳酸发酵菌作为发酵剂，其代谢产物主要 为乳酸，从而降低酸菜产品中乙醇、乙酸等异性乳酸发酵的代谢产物。这也许是由于商品酸菜在中人为加入山梨酸钾、脱氢乙酸钠等食品添加剂所致。

2.4 挥发性化合物分析

由图4可知，酸菜样品之间代谢物存在显著差异，能够很好地分离。通过PLS-DA模型，筛选变量重要性投影大于1的组分作为差异代谢产物，主要为异硫氰酸甲酯、软脂酸、十五烷、月桂烯、2-庚酮、2-甲基二硫等，均是酸菜风味的来源成分。在不同酸菜样品之间，代谢物丰度也存在显著差异（P＜0.05）。如表3所示，从种类上看，L. paracasei HD1.7发酵酸菜挥发性化合物种类共（59±1）种，最少的为自然发酵酸菜（51±0）种。从相对含量上看，L. paracasei HD1.7发酵酸菜（（94.87±8.23）%）和黑大酸菜（（94.49±7.32）%）挥发性化合物的总含量显著高于其他酸菜（P＜0.05）。

表 3 不同酸菜样品挥发性化合物种类及相对含量Table 3 Volatile flavor compounds and their relative contents in different pickled Chinese cabbages

图 4 不同酸菜样品代谢物PCA模型Fig. 4 PCA analysis of metabolites in different pickled Chinese cabbages

酯类是所检测到挥发性化合物中种类最多、相对含量最为丰富的物质，己酸乙酯具有强烈的水果香气，味甜爽口，对酸菜的风味贡献十分重要[24-25]。酯类较高的为L. paracasei HD1.7发酵酸菜（（31.69±1.23）%）、黑大酸菜（（23.70±1.82）%），最少的为袁滋袁味酸菜（（20.06±1.38）%）。醛类可以赋予酸菜清香、坚果香和果香[26-27]。好大姐酸菜、古嫂子酸菜、翠花酸菜醛类物质较高分别为（1.18±0.09）%、（1.04±0.07）%、（1.47±0.32）%，边府记酸菜含量最低为（0.59±0.04）%。不同酸菜中烷类物质的含量较高，但对酸菜风味的贡献不大。酮类赋予食品奶油的香味，其中3-甲基-2-丁酮具有黄油的香气、2-庚酮具有清香的气味[25]。酮类较高的为黑大酸菜酸菜（（9.48±0.43）%）、袁滋袁味（（8.14±0.23）%），最少的为王致和酸菜（（3.00±0.11）%）。硫化物来源于白菜本身，含硫氨基酸最终转化为含硫化合物[28]。L. paracasei HD1.7发酵酸菜中含硫化合物最高为（5.41±0.24）%，其次为黑大酸菜（（4.12±0.12）%），最少的为边府记酸菜（（1.13±0.04）%）。乳酸菌可以将大白菜中的糖类转化为乙醇、异戊醇等醇类，其赋予酸菜水果香、甜香以及酒香味[29-30]。L. p aracasei HD1.7进行乳酸主要产物的同型乳酸发酵，因此L. paracasei HD1.7发酵酸菜醇类物质的相对含量较低仅为（7.76±0.11）%，相对含量较高的为边府记酸菜（（10.73±2.18）%）、朱老六酸菜（（11.10±2.62）%）。综上可知，不同酸菜样品挥发性化合物的组成及相对含量存在较大差别，无规律可寻，可能是由于外源的加入不同发酵剂、添加剂，且添加剂的含量和种类并不清楚，以及原材料的差异所导

致。L. paracasei HD1.7发酵酸菜中各挥发性化合物均处于较高水平，因此风味浓郁。

2.5 酸菜感官评价

图 5 不同酸菜样品感官评价结果Fig. 5 Sensory evaluation of different pickle Chinese cabbages

不同酸菜样品感官评价评分从大到小依此是：黑大酸菜、L. paracasei HD1.7发酵酸菜、边府记酸菜、袁滋袁味酸菜、古嫂子酸菜、朱老六酸菜、王致和酸菜、翠花酸菜、好大姐酸菜、自然发酵酸菜（图5）。色泽、香气、口味、脆度等指标进行评价，L. paracasei HD1.7发酵酸菜的分数高于其他9 种（P＜0.05）。L. paracasei HD1.7作为发酵剂可显著改善酸菜的感官品质。

3 结 论

本研究以分离自酸菜发酵液的L. paracasei HD1.7为发酵剂，利用HPLC和GC-MS技术，比较分析了

L. paracasei HD1.7发酵酸菜、自然发酵酸菜及8 种商品酸菜样品酸度及代谢物。黑大酸菜、L. paracasei HD1.7发酵酸菜、边府记酸菜和袁滋袁味酸菜中有机酸含量显著高于其他几种酸菜（P＜0.05）。其中乳酸是有机酸中的主要成分。不同酸菜样品中，酸度与VC含量呈正相关，与亚硝酸盐含量呈负相关。其中L. paracasei HD1.7发酵酸菜中，酸度较高，VC含量最大，亚硝酸盐含量最低。不同商品酸菜样品中甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇无规律性差异。不同样品中挥发性风味物质的种类和相对含量均有显著差异，L. paracasei HD1.7发酵酸菜挥发性成分种类最多，达（59±1）种，相对总含量为（94.87±8.23）%，显著高于其他样品（P＜0.05）。

L. paracasei HD1.7作为酸菜发酵剂，可以增加酸菜的酸度，降低亚硝酸盐含量，防止VC降解，增加风味物质种类和含量，从而提高酸菜安全性和营养价值。

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Comparative Evaluation of Metabolite Composition and Quality of Lactobacillus paracasei HD1.7 Fermented and Commercial Pickled Chinese Cabbage

ZHAO Dan1,2, DU Renpeng1,3, WANG Yao1, WANG Qi1, NA Jin1, GUO Shangxu1, GE Jingping1,2,*
(1. Key Laboratory of Microbiology, Life Science College, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150500, China; 3. School of Chemical Eng ineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Lactobacillus paracasei HD1.7, isolated from spent brine from pickled Chinese cabbage, was used as a starter culture to establish and investigate a microbial ecosystem model for pickled Chinese cabbage fermentation, i.e., HD1.7 fermentation in comparison with natural fermentation as control. High performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were adopted to detect organic acid, acidity, nitrite, VC, glycerol, ethanol, mannitol, 2,3-butanedilol and volatile flav or compounds in the model and control groups and eight commercial products. It was found that the org anic acid content and acidity were positively correlated in all samples. The organic acids contents of Heida branded pickled Chinese cabbage, HD1.7 fermented Chinese cabbage and Yuanziyuanwei branded pickled Chinese cabbage were (13.21 ± 0.13), (13.20 ± 0.17) and (13.13 ± 0.13) g/L, respectively, which were higher than those of other samples. Furthermore, Heida branded pickled Chinese cabbage, HD1.7 fermented Chinese cabbage and Bianfuji branded pickled Chinese cabbage showed a significantly lower nitrite concentration and a significantly higher VC concentration (P ＜ 0.05) and therefore had better safety and nutritional value than did othe r samples in addition to higher conten ts of flavor compounds and better sensory quality. In conclusion, these results may help to monitor the production process of pickled Chinese cabbage and establish quality standard for pickled Chinese cabbage and they are of great practical significance to enhance the quality stability of pickled Chinese cabbage and the level of industrial development.In addition, these results also indicate the promising application potential of L. paracasei HD1.7 as a starter culture in industrial production of pickled Chinese cabbage.

2016-06-29

国家自然科学基金青年科学基金项目（31300355）；哈尔滨市科技局青年后备人才项目（2014RFQXJ101）；黑龙江省政府博士后项目（LBH-Z15214）；黑龙江大学杰出青年基金项目（JCL201305）

赵丹（1980—），女，副教授，博士，研究方向为微生物生态学及代谢组学。E-mail：zhaodan4u@163.com

*通信作者：葛菁萍（1972—），女，教授，博士，研究方向为微生物生态学及微生物遗传育种。E-mail：gejingping@126.com

10.7506/spkx1002-6630-201710002

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0006-06

赵丹, 杜仁鹏, 王瑶, 等. 副干酪乳杆菌HD1.7发酵酸菜与商品酸菜代谢物比较与品质评价[J]. 食品科学, 2017, 38(10): 6-11. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710002. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Dan, DU Renpeng, WANG Yao, et al. Comparative evaluation of metabolite composition and quality of Lactobacillus paracasei HD1.7 fermented and commercial pickled Chinese cabbage[J]. Food Science, 2017, 38(10): 6-11. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710002. http://www.spkx.net.cn