结核分枝杆菌higA基因的扩增及生物信息学分析*

董 娜，刘 丹，付玉荣，伊正君△

(潍坊医学院:1.医学检验学系；2.临床学院病原生物学教研室，山东潍坊 261053)

结核分枝杆菌higA基因的扩增及生物信息学分析*

董 娜1，刘 丹1，付玉荣2，伊正君1△

(潍坊医学院:1.医学检验学系；2.临床学院病原生物学教研室，山东潍坊 261053)

目的 对结核分枝杆菌的higA基因进行扩增，同时利用生物信息学方法分析其编码蛋白的结构和功能。方法 从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增higA基因，对扩增产物进行测序。利用生物信息学网站和软件分析higA蛋白的理化性质、信号肽、空间结构、抗原表位等。结果 higA基因扩增产物与预期一致，大小为450 bp。higA蛋白共149个氨基酸，理论等电点7.93，脂溶性系数94.30，不稳定系数36.57，预测该蛋白为稳定蛋白。higA蛋白无信号肽，含10个磷酸化位点和多个潜在的抗原表位。结论 成功扩增出结核分枝杆菌higA基因。

分枝杆菌，结核；基因扩增；higA；生物信息学分析

据WHO 2015年结核统计报告显示， 2014年结核病全球新发病例960万，150万死于肺结核，我国新发结核病例93万人，居世界第33位[1]。目前，结核病的药物治疗主要是针对活动性肺结核，而潜伏性和耐药性肺结核为结核病治疗的两大难题。因此，深入研究结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)的耐药性和持留性的机制，发现结核病治疗的新靶点，研发新药，阻止结核病疫情的发展至关重要。研究发现，大量细菌的持留性和耐药性的产生机制是由于毒素-抗毒素系统(TAS)的激活[2-3]，抗毒素被细胞内Lon和Clp蛋白酶降解或消耗[4]，毒素蛋白释放出来，干扰或改变细胞三磷酸腺苷(ATP)、细胞壁合成和DNA复制，最终导致细胞死亡或耐药持久性的形成[5]，毒素还可以中和细菌中质粒的抗性[6]。Kim等[7]和Fineran等[8]等研究发现TAS与细菌生物膜的形成及噬菌体的防御密切相关。致病性的MTB中有88对假定的TAS[9]，而非致病性的耻垢分枝杆菌仅有2对假定的TAS，进一步说明TAS的数量与细菌的致病性相关[10]。

higBA TAS由细菌染色体编码，属于Ⅱ型TAS。在对higBA作用机制的研究中发现，higA通过直接抑制 higB P2启动子表达，进一步控制Rv1954A-Rv1957(Rv1955-higB毒素和Rv1956-higA抗毒素)的表达[11]，删除higA抗毒素时 higB毒素异常高表达，导致MTB死亡[12]。因此，若能利用higBA系统调控MTB的凋亡，将是结核病治疗方面的重大突破。

1 材料与方法

1.1 材料 MTB H37Rv基因组DNA由本实验室提供。主要试剂：Prime STAR®HS DNA Polymerase、2×GC Buffer、Taq酶、PCR引物均购自山东赛恩斯科技有限公司。DNA Marker购自重庆海韵生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 从GenBank中检索H37Rv higA的基因编码序列，用Primer 5.0软件进行引物设计。上游引物P1:5′-GAT GGT ACC ATG AGC ATT GAC TTC CCT-3′；下游引物P2:5′-CTA AAG CTT TCA TGC CAC CTC AAC CTG-3′，引物长度为27 bp。引物由山东赛恩斯科技有限公司合成。

1.2.2 MTB higA基因的PCR扩增 以MTB基因组DNA作为反应模板，P1，P2为引物进行扩增，扩增体系如下：无菌水为17.7 μL，2×GC Buffer为25.0 μL，dNTP为 4.0 μL，P1、P2 各1.0 μL，DNA模板为1.0 μL，Taq酶为0.3 μL，总体积为50.0 μL。扩增条件：共35个循环，其中95.0 ℃预变性3 min；98.0 ℃ 10 s；59.8 ℃ 10 s；72.0 ℃ 45 s；最后72.0 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 higA基因的PCR产物序列分析 将经初步鉴定正确的PCR产物送南京巴傲德生物科技有限公司测序，并通过NCBI上的Blast进行比对分析。

1.2.4 higA蛋白的生物信息学分析 利用蛋白质分析系统EXPASYP Proteomic中Protparam程序分析higA蛋白的理化性质，利用protscale、SignaIP 4.1和MotifScan分析higA蛋白的亲(疏)水性、信号肽以及翻译后修饰位点。采用蛋白质分析系统EXPASY proteomic中的GOR4 和SWISS_MODEL 进行蛋白质二级结构的分析和空间构象的模拟。利用Bepipred 1.0b server 和SYFPEITHI软件预测higA蛋白的抗原表位。

2 结 果

2.1 higA基因的PCR扩增 PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在450 bp处出现特异性条带，与预期大小一致，见图1。

M：DNA-相对分子质量标准(DL2000)；1：higA基因PCR产物。

图1 higA基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.2 higA蛋白的生物信息学分析

2.2.1 higA蛋白的理化性质 该蛋白由149个氨基酸组成，其中Ala(A)丙氨酸17个，占总氨基酸的11.4%，含量最高。分子式为C735H1195N221O219S4，原子总数2 374，相对分子质量16 760.1，理论等电点7.93，脂溶性系数94.30，不稳定系数36.57 ，为稳定性蛋白。当成熟肽末端为甲硫氨酸时，在哺乳动物网织红细胞体外半衰期为30 h，在酵母和大肠杆菌中的半衰期分别大于20 h和10 h。利用SignaIP 4.1，分析蛋白的氨基酸序列显示无信号肽。higA蛋白的平均疏水性系数为-0.349 (图2)，为亲水性蛋白。

图2 higA蛋白的亲(疏)水性

2.2.2 higA蛋白的二级结构 应用GOR4进行二级结构预测，α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)、β-转角(Tt)和无规则卷曲(Cc)所占比例分别为43.62%、17.45%、4.70%、34.23%，该蛋白无规则卷曲含量高，结构比较松散。

2.2.3 higA蛋白的翻译后修饰位点 经Motif Scan分析，higA蛋白共有10个翻译后修饰位点：5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(28-31、52-55、68-71、101-104、117-120)，5个蛋白激酶C磷酸化位点(24-26、101-103、113-115、117-119、142-144)。

2.2.4 33级结构利用蛋白质分析系统EXPAY proteomic (http://expasy.org/tools/#pattern )43级结构模型组装软件SWISS-MODEL模拟higA的三级结构,结构见图3。

图3 higA蛋白的同源模建空间结构

2.2.5 抗原表位的预测 利用Bepipred 1.0b server 软件预测higA蛋白质有1个潜在的B细胞抗原表位,位置在1aa-9aa。应用SYFPEITHI在线程序预测higA共含有10个CTL细胞表位见表1；6个Th细胞表位见表2。

表1 SYFPEITHI预测higA的限制性CTL表位

表2 SYFPEITHI预测higA的辅助性T细胞表位

3 讨 论

TAS最早是在1983年由Ogura和Hiraga作为质粒的稳定系统而发现的。TAS共5种类型，其中Ⅱ型TAS由染色体或质粒编码，共9个家族(ccd AB、maz EF、vap BC、phd/doc、par DE、hig BA、rel BE、 hip B和hic AB)，通过蛋白复合物抑制毒素蛋白的活性[8]，与细菌压力状态下的存活状态、耐药性和持留性密切相关[13]。因此，可通过TAS来解决临床上耐药和持留菌的治疗问题。

近年来，随着基因组学和蛋白质组数据库的不断扩大，生物信息学方法在微生物致病性研究中的应用越来越广泛，在疾病防治中发挥重大作用[14-15]。本研究从MTB基因组中成功克隆出higA基因，并运用生物信息学方法对higA蛋白的理化性质、结构和功能进行分析，发现该蛋白共149个氨基酸，理论等电点 7.93，属于稳定性蛋白质，呈疏水性。β转角和无规则卷曲位于蛋白表面，有利于抗体嵌合，常含有优势抗原表位[16]。higA蛋白中β转角和无规则卷曲含量高，提示其容易与抗体嵌合，可能含有潜在的抗原表位。higA蛋白的空间构象能够直观的展示蛋白质的立体构象，对进一步研究其结构与功能的关系等具有重大意义。综上所述，本研究初步认识了higA蛋白的基本结构和功能，为进一步研究higA蛋白在结核病治疗的应用价值方面提供了更多的理论依据。

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Analysis of amplification and bioinformatics on mycobacterium tuberculosis protein higA*

DongNa1,LiuDan1,FuYurong2,YiZhengjun1△

(1.DepartmentofMedicalLaboratory；2.DepartmentofPathogenBiology,WeifangMedicalUniversity，Weifang，Shandong261053,China)

Objective To amplify the higA gene from the Mycobacterium tuberculosis,and to analyze the structure and function of their encoded proteins by using bioinformatics.Methods Total DNA was extracted from Mycobacterium tuberculosis.PCR of higA was performed and the products were sequenced.The biological features of the higA protein including，its physical and chemical properties,signal peptide,spatial structure and epitopes were analyzed by using software online.Results The PCR products of higA were 450 bp in length，which were consistent with the expected size.The higA protein consisted of 149 amino acids and had the following characteristics:a theoretical isoelectric point of 7.93，a fat-soluble factor of 94.30，and instability coefficient of 36.57.The higA protein had no signal peptide,containing 10 phosphorylation sites and multiple potential epitopes.Conclusion Mycobacterium tuberculosis higA gene can be amplified by PCR and the characteristics of higA protein is identified.

mycobacterium tuberculosis；gene amplification；higA；bioinformatics analysis

物信息学·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.024

国家自然科学基金资助项目(81470001，81170080)。 作者简介： 董娜(1990-)，在读硕士，主要从事分子诊断方面研究。△

，E-mail:fuyizhengjun@163.com。

R378.91

A

1671-8348(2017)14-1944-03

2016-11-20

2017-01-06)