蒙古沙冬青深色有隔内生真菌磷脂脂肪酸生物标记

王少杰，左易灵，薛子可，贺学礼

(河北大学 生命科学学院，河北保定 071002)

蒙古沙冬青深色有隔内生真菌磷脂脂肪酸生物标记

王少杰，左易灵，薛子可，贺学礼

(河北大学 生命科学学院，河北保定 071002)

为探究深色有隔内生真菌(DSE)磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记在DSE分类鉴定和土壤微生物检测上的应用，分别于宁夏银川、沙坡头、甘肃民勤和内蒙古乌海4个样地采集蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根样，分离得到DSE，结合形态学和分子生物学进行分类鉴定，并利用Sherlock微生物鉴定系统检测DSE脂肪酸组成。4个样地共分离得到12株DSE，可划分为7属7种。通过对DSE脂肪酸组分进行检测，共得到91种已知脂肪酸和12种Summed Feature型。DSE脂肪酸以C14酸、C16酸和C17酸为主，其中16∶0、16∶1 Cis 9 (ω7)、18∶2 CIS 9,12/18∶0a、18∶0 和Summed Feature 8为DSE共有脂肪酸，部分菌株中还具有特有脂肪酸组成，其可作为土壤微生物检测的生物标记。通过脂肪酸分析可将12株DSE分为4个类群，将3株DSE鉴定到种。结果表明，PLFAs生物标记可作为DSE分类鉴定指标，并为土壤微生物检测提供依据。

DSE；磷脂脂肪酸；生物标记

深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes，DSE)是一类定殖在植物根皮层细胞或细胞间隙的土壤内生真菌，能够产生黑色有隔菌丝和微菌核[1]。DSE广泛分布于各种生境[2-4]，尤其在干旱半干旱[5-6]、重金属矿区[7-8]等胁迫环境中具有较高定居率。目前，DSE分类学地位和生态学功能尚不清楚，大部分DSE只在特殊条件下才能诱导培养产生分生孢子[9]。在DSE研究中，通常结合形态学特征和分子生物学手段进行鉴定，徐风美等[10]在研究油松根部真菌群落结构及多样性中，共鉴定出23种真菌，包括8种DSE。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)是微生物细胞膜的重要组成成分，其含量在自然生理条件下相对稳定，具有遗传稳定性[11]，可作为微生物分类的重要标记[12]。自Abel等[13]首次证实细胞脂肪酸可用于细菌鉴定之后，PLFA生物标记已广泛应用于细菌的分类鉴定，其结果与传统方法鉴定结果一致[14]。此外，脂肪酸分析也可用于微生物分类，通过对比芽孢杆菌模式菌株进行脂肪酸组分和16S rRNA基因系统进化分析，发现脂肪酸分析能够根据芽孢杆菌亲缘关系和生物学特性进行分类[15]。不同的微生物中具有不同的PLFA组成和含量，可用来标记特定微生物类群和生物量，用于土壤中微生物量和群落组成分析[16]。美国MIDI公司基于脂肪酸分析技术而开发的全自动微生物鉴定系统(Sherlock Microbial Identification System，Sherlock MIS4.5)，已广泛应用于微生物分类鉴定和微生物群落分析，但有关DSE磷脂脂肪酸的研究尚未见详细报道。

本试验以12株DSE为研究对象，通过比较脂肪酸分析法、形态学和分子生物学鉴定结果，以期为脂肪酸分析技术应用于DSE分类鉴定和土壤微生物群落分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

12株供试菌株均从西北荒漠地区蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根样中分离得到，现存于河北大学生命科学学院菌根生物技术研究室(表1)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株活化培养 所有供试菌株均用PDA培养基进行活化，27 ℃黑暗培养20 d，观察菌落形态和产孢结构。

1.2.2 ITS序列扩增及比对 利用DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取DNA，作为ITS序列扩增模板。ITS扩增引物为ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)(北京天一辉远生物科技有限公司)。PCR扩增采用20 μL体系：2×PCRTaqMix 10 μL，引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，模板3.5 μL，超纯水5.50 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR原液进行测序(北京三博远志生物技术有限责任公司)，所得ITS序列在NCBI进行Blast序列比对。

1.2.3 DSE磷脂脂肪酸提取[17]取40 mg菌株培养物，置于8 mL螺口玻璃管中，加入1 mL溶液Ⅰ，拧紧螺盖，沸水浴5 min，取出震荡5～10 s，再度沸水浴25 min；待样品管冷却后，加入2 mL溶液Ⅱ，盖严震荡，随后精确控制80±1 ℃水浴10 min，冷水浴冷却；加入1.25 mL溶液Ⅲ，快速震荡10 min，弃去下层水相；在剩余有机相中加入3 mL溶液Ⅳ，快速震荡5 min，待上层溶液澄清后，取三分之二有机相(大于0.3 mL)置气相色谱样品瓶中，备用。

其中溶液Ⅰ(皂化试剂)：45 g氢氧化钠溶于150 mL甲醇及150 mL蒸馏水；溶液Ⅱ(甲基化试剂)：97.5 mL浓盐酸，1 375 mL甲醇溶于65 mL蒸馏水；溶液Ⅲ(萃取试剂)200 mL正己烷(色谱纯)与200 mL甲基叔丁基醚(色谱纯)混合均匀；溶液Ⅳ(洗涤试剂)：10.8 g氢氧化钠溶于900 mL蒸馏水。

1.2.4 DSE磷脂脂肪酸检测及分析 气相色谱系统采用美国Agilent 7890B型，包括全自动进样装置、色谱柱(19091B-102，25 m×0.200 mm×0.33 μm)及氢火焰离子化检测器；分析软件为 Sherlock MIS系统，采用SFUNGI6方法对脂肪酸甲酯混合物标样(MIDI公司提供)和样品进行检测。

1.3 数据处理

脂肪酸数据结果利用SPSS 20进行处理，采用Ward法、块度量标准进行聚类分析。ITS序列经Clustal X[18]对齐后，用软件Mega 4[19-20]进行聚类分析(方法为Neighbour-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)。

表1 样地概况

2 结果与分析

2.1 DSE形态学特征

由图1可知，供试菌株在PDA培养基中形成不同的菌落形态，菌落颜色以灰色、黑色和褐色为主，大部分菌落中间具有“隆起”结构，其中菌株3A SPT1218、SPT-11225和8YC菌落中具有同心轮纹结构。通过插片观察，供试菌株均能产生深色有隔菌丝，其中菌株6SPT、SPT-11225、2SPT1218、0-10MQ1717-3、8YC和4YC0-10具有产孢结构，其中菌株WH2-1和WH3-2菌丝末端膨大形成厚垣孢子。12种供试DSE菌株主要识别特征见表2。

表2 DSE形态学特征

2.2 ITS序列测定及比对

结果表明，ITS序列片段长度是525～617 bp。通过Blast序列比对，发现12株DSE归于7属，即枝孢属Cladosporium、外瓶霉属Exophiala、瓶霉属Phialophora、异茎点霉属Paraphoma、茎点霉属Phoma、Pleosporales和埃里隔孢属Embellisia。结合形态学特征，将菌株2SPT1218、6SPT、SPT-11225、0-10MQ1217-2-2、0-10MQ1217-3、8YC、WH2-1和WH3-2准确鉴定到种；其他4株由于没有产孢结构或生长特征不明显，只能通过ITS序列比对鉴定到属(表3)。

1：Ⅰ.3A SPT1218 菌丝 Hypha (H)； 2：Ⅱ.6SPT 菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；3：Ⅲ.SPT-11225 菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S); 4：Ⅳ.2SPT1218 菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S); 5：Ⅴ.0-10MQ1217-2-2 菌丝 Hypha(H)； 6：Ⅵ.0-10MQ1717-3菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；7：Ⅶ.MQ1225菌丝 Hypha(H)；8：Ⅷ.2MQ0-10菌丝 Hypha(H)；9：Ⅸ.8YC 菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；10：Ⅹ.4YC0-10 菌丝 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；11：Ⅺ.WH2-1 菌丝 Hypha(H)、厚垣孢子 Chlamydospore (C)；12：Ⅻ.菌丝 Hypha(H)、厚垣孢子 Chlamydospore(C)

表3 DSE序列比对

2.3 DSE脂肪酸鉴定结果和ITS序列比对结果比较

Sherlock MIS系统主要根据保留时间和峰值进行数据库内搜索匹配。只要数据库有的菌种，且第1个相似指数大于0.5并与第2个相似指数相差0.1以上，则可准确鉴定到种。若相似指数在0.3～0.5，可准确鉴定到属。

由表4可知，菌株3ASPT1218、6SPT和8YC在Sherlock MIS系统真菌数据库中有匹配菌种，其中菌株3ASPT1218和8YC均为皮炎外瓶霉Exophialadermatitidis，相似指数分别为0.468和0.416；菌株6SPT第1鉴定结果为皮炎外瓶霉Exophialadermatitidis，相似指数为0.466，第二鉴定结果为沙门外瓶柄霉Exophialasalmonis，相似指数为0.416。与形态学和分子生物学鉴定结果比较，3ASPT1218和8YC通过Sherlock MIS系统能准确鉴定到属，但6SPT的ITS鉴定结果为甘瓶霉Phialophoramustea，与Sherlock MIS系统两个鉴定结果明显不同。

表4 菌株脂肪酸及ITS鉴定

2.4 两种聚类分析方法比较

由图2可知，12株DSE分为3大分支其中包括4个小类群。类群Ⅰ包括3株菌，0-10 MQ1217-2-2为菊异茎点霉Paraphomachrysanthemicola，4YC0-10和2MQ0-10为茎点霉属Phoma；类群Ⅱ为埃里砖格孢属Embellisia类群，由WH2-1和WH3-2组成；类群Ⅲ由4株菌组成，其中3ASPT1218、8YC和SPT-11225位于一小分支上，属于外瓶霉属Exophiala；MQ1225属于腔菌目Pleosporales，位于另一小分支上；类群Ⅳ中，2个枝孢属菌Cladosporium2SPT1218和0-110MQ1217-3位于一个分支，瓶霉属菌Phialophora6SPT在另一分支。

脂肪酸聚类分析共分出2大分支其中包括4个小类群。类群Ⅰ由沙打旺埃里砖格孢Embellisiaastragalif和 2株茎点霉菌 Phoma sp.组成；类群Ⅱ中含有2种枝孢菌Cladosporium和1种埃里砖格孢Embellisia；类群Ⅲ由5株菌组成，包含2种外瓶霉菌Exophiala、2种瓶霉菌Phialophora和1种异茎点霉菌Paraphoma；类群Ⅳ为MQ1225腔菌目菌Pleosporales(图3)。

比较以上两种聚类图可知，2种分类方法均可将菌种细分为4个小类群。通过脂肪酸聚类分析，可以将一些亲缘关系近的菌株聚到同一小类群中，但与分子分类法相比，脂肪酸聚类分析未能完整反映出菌株的分类地位。

2.5 DSE脂肪酸成分分析

12株DSE共检测出91种已知PLFA和12种Summed Feature型，以支链脂肪酸为主，C16酸种类最多，共17种；其次是C14酸和C17酸，均含10种。脂肪酸16∶0、16∶1 Cis 9 (ω7)、18∶2 CIS 9,12/18∶0a、18∶0和Summed Feature 8为12株DSE共有，除WH2-1为34.42%和2MQ0-10为37.81%之外，其他菌株中4种PLFAs的相对含量占全部脂肪酸含量的71.48%～95.5%,而其他大部分脂肪酸组分相对含量不足1%。不同样地检测出的PLFA种类各不相同，其中，民勤共发现68种，沙坡头为64种，银川为38种，乌海27种。沙坡头共分离得到4株DSE，菌株PLFA种类为15～33种，其中2SPT1225含有种类为33种；民勤分离得到的4株DSE脂肪酸种类为25～36种，其中MQ1225种类为36种；银川2株，8YC为25种，4YC0-10为21种；乌海2株，WH2-1为19种，WH3-2为13种。

此外，根据菌株中脂肪酸中出现的频率，可以将PLFA分为高频次、低频次和微频次，微频次只在一种菌株中出现，可以作菌株的特征脂肪酸。除4YC0-10、WH2-1和WH3-2之外，其他9株DSE均发现有特征脂肪酸(表5)。

图2 DSE系统发育树

图3 DSE的脂肪酸聚类分析

3 讨 论

近年来，DSE虽然因其广泛分布性、可培养性以及潜在的生态学功能[21]受到越来越多的关注，但对其种类组成和分类地位仍缺乏共识。有研究表明，前期以形态学为基础的对DSE的描述和鉴定十分混乱[22]，随着越来越多的DSE被发现，传统的形态学特征已经不适用于菌种的分类。基于ITS序列分析的分子生物学虽已成功运用到DSE分类鉴定中，但由于真菌ITS序列高度保守性,在间隔区上表现的差异性较小,不适合于属内种及种群的标记[23]。因此，在DSE鉴定方面，依靠形态学和分子生物学获得的信息依然有限，需要结合更多的技术和资料库。PLFA分析法[24]是基于脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术，主要是通过分析微生物细胞膜PLFA组分进行菌种鉴定。目前，基于PLFA分析的Sherlock MIS系统已广泛用于微生物分类鉴定。吴愉萍等[25]证实该系统对TSBA培养基培养的细菌分类鉴定具有很高准确率。黄朱梁等[26]在对贻贝中分离的蜡样芽孢杆菌研究中发现，TSBA 培养待检微生物、获菌量控制在 100～120 mg，能够通过Sherlock MIS系统准确鉴定出菌种。相对于形态学和分子生物学，PLFA分析法操作安全、简单、快速，实验成本低，在一定程度上能弥补其不足。

表5 DSE磷脂脂肪酸种类数及特征脂肪酸种类

本试验利用Sherlock MIS系统对DSE磷脂脂肪酸组分进行检测时发现，不同样地检测出的PLFAs种类差异显著，这可能与分离的菌株数有关，也可能与所处的生态环境有关[27]。此外，分离自不同样地的菌株中PLFAs组成和含量也不尽相同，说明环境条件的改变能够影响PLFAs的组成[28]，其组成和含量变化可能有助于DSE适应当前的环境，两者之间的关系尚需进一步研究。研究还发现，尽管不同菌株中PLFA组成和相对含量不同，但是所有供试DSE中仍含有一些共有脂肪酸。对共有PLFAs组成和相对含量进行分析，结果表明，4种共有脂肪酸组成相对含量显著大于其他PLFAs组分，是DSE的主要PLFA组成。另外，一些DSE菌株中还存在有特有脂肪酸组成，可作为特征脂肪酸。PLFAs作为细胞膜的主要成分，是微生物遗传物质重要表达产物，与DNA具有同源性，不同菌种中其组成和含量具有菌种特异性。因此，DSE的主要脂肪酸和特征脂肪酸可为真菌脂肪酸分类和快速鉴定提供重要依据[29]，也可作为土壤中微生物检测的生物标记。

PLFAs主要存在于活体细胞中，其周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解[30]，脂肪酸结构与种类多样，且对环境因素敏感，因此微生物PLFAs组成和含量会随着提取时间和培养条件的变化而发生变化[31]；此外，尽管MIDI 公司为脂肪酸鉴定制定了一套严格的操作规范，但实际试验过程中仍会出现一些操作偏差，这些因素都会影响DSE脂肪酸组成和含量的检测，进而影响DSE的脂肪酸聚类分析。通过对比Sherlock MIS系统中的真菌资源库和ITS序列基因数据库发现，Sherlock MIS系统中的真菌库容较小，只收录30属62种真菌菌种，其最近更新时间是在2005年，使得部分DSE菌种未能通过脂肪酸分析法得到可信鉴定。

Sherlock MIS系统作为一种微生物鉴定方法，基于以上原因，虽然未能实现对所有供试DSE菌株的科学分类鉴定，但本试验已证实脂肪酸分析法在DSE分类鉴定上的潜能。因此，对于分类系统尚未建立的DSE类群而言，在形态学分类基础上，可通过进一步优化脂肪酸分析，结合分子方法对其科学分类鉴定。

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(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Phospholipid Fatty Acid Biomarkers of Dark Septate Endophytes in Roots ofAmmopiptanthusmongolicus

WANG Shaojie,ZUO Yiling,XUE Zike and HE Xueli

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding Hebei 071002,China)

To explore application of phospholipid fatty acid (PLFA) biomarkers in dark septate endophytes (DSE) classification,identification and detection of soil microorganisms,root samples ofAmmopiptanthusmongolicuswere collected from Yinchuan,Shapotou,Minqin and Wuhai in northwestern China.DSE strains were isolated from roots and identified by morphology and ITS sequence analysis.DSE fatty acid composition was detect by Sherlock Microbial Identification System (Sherlock MIS).A total of 12 DSE strains were separated from 4 sites,which it could be diveided into 7 genera and 7 species .The 91 known fatty acids and 12 Summed Feature were detected by the Sherlock MIS,and C14acid,C16acid and C17acid were the major fatty acids of DSE.Of these,16∶0,16∶1 Cis 9 (ω7),18∶2 CIS 9,12 / 18∶0a,18∶0 and Summed Feature 8 were the total fatty acids.Some of the strains also had the specific fatty acid composition,and specific fatty acids could be used as a biomarker for the detection of soil microorganisms.12 strains of DSE were divided into 4 groups by fatty acid analysis,and 3 strains of DSE were identified to the species.This study suggested that PLFAs biomarkers could be used as DSE classification identification indicators,and provided a basis for the detection of soil microorganisms.

DSE; Phospholipid fatty acids;Biomarker

WANG Shaojie,male,master student.Research area:biology of mycorrhizal fungi.E-mail:wsj663@163.com

HE Xueli,male,professor,doctoral supervisor.Research area:ecology and biology of mycorrhizal fungi.E-mail:xuelh1256@aliyun.com

日期：2017-05-22

2016-05-03

2016-06-18

国家自然科学基金(31170488)。

王少杰，男，硕士研究生，从事菌根生物学研究。E-mail:wsj663@163.com

贺学礼，男，教授，博士生导师，从事菌根生物学与生态学研究。E-mail:xuelh1256@aliyun.com

Q939.96

A

1004-1389(2017)05-0781-09

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.036.html

Received 2016-05-03 Returned 2016-06-18

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31170488).