H2S可能作为H2O2的上游信号介导茉莉酸甲酯诱导竹根姜对青枯菌的抗性

周大祥，熊 书

(1.重庆三峡学院 生命科学与工程学院，重庆万州 404100；2.重庆大学 生命科学学院，重庆市基因功能与调控重点实验室，重庆 400300；3.重庆三峡医药高等专科学校 基础医学部，重庆万州 404120)

H2S可能作为H2O2的上游信号介导茉莉酸甲酯诱导竹根姜对青枯菌的抗性

周大祥1,2，熊 书3

(1.重庆三峡学院 生命科学与工程学院，重庆万州 404100；2.重庆大学 生命科学学院，重庆市基因功能与调控重点实验室，重庆 400300；3.重庆三峡医药高等专科学校 基础医学部，重庆万州 404120)

为探讨H2S和H2O2在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导竹根姜抗姜瘟病过程中的上下游关系，以竹根姜幼苗为研究对象，采用MeJA、NH2OH+MeJA、AsA+MeJA、无菌水等进行喷雾，观察竹根姜发病情况，并对H2S、H2O2、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和木质素等指标进行检测。结果显示，MeJA处理可以显著降低竹根姜的病情指数，提高抗病性，而H2S合成抑制剂NH2OH和H2O2清除剂AsA均抑制MeJA诱导的抗病效果。进一步研究发现，MeJA能够明显促进H2S(主要由半胱氨酸脱巯基酶合成)和H2O2的合成以及半胱氨酸脱巯基酶的活性，提高木质素合成相关酶(PAL和POD)活性，促进木质素合成。H2S合成抑制剂NH2OH可降低半胱氨酸脱巯基酶的活性并抑制H2S和H2O2的产生，而H2O2清除剂AsA可抑制H2O2的产生，但对H2S的合成和半胱氨酸脱巯基酶的活性没有影响。由此证明，H2S可能作为H2O2的上游信号参与竹根姜对MeJA的响应。MeJA在竹根姜细胞内进行有效的信号传导，通过调控细胞内下游信号分子H2S和H2O2的产生，激活木质素合成相关酶的活性，促进木质素的合成，提高竹根姜对青枯菌的抗性。

硫化氢；过氧化氢；茉莉酸甲酯；竹根姜；青枯菌

茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(methyl jasmonate，MeJA)作为外源信号分子，已被证明能够广泛诱导植物的抗病反应[1]。大量的研究结果表明，外源施用JA或MeJA可有效诱导防御基因的表达和木质素的合成，进而提高植物抗病性[2]。硫化氢(hydrogen sulphide,H2S)是一种近年来发现的信号分子，在植物的生长发育[3]和逆境胁迫[4-5]中起重要作用。植物主要通过L/D-半胱氨酸脱巯基酶催化半胱氨酸分解成H2S[6]。对甘蓝型油菜(Brassica napus)抵御病原体入侵的研究证实，来自L-半胱氨酸脱巯基酶的H2S起重要作用[7]。最新研究发现，H2S作为信号分子在植物的抗病应答[8]中起重要作用。前期研究结果表明，0.1 mmol·L-1的MeJA处理可显著诱导竹根姜内源信号分子H2S和H2O2的迸发，降低姜瘟病的发生[9]。但H2S和H2O2之间的关系以及它们与木质素合成的关系还不清楚。因此，本研究以竹根姜为材料，探讨H2S和H2O2在MeJA诱导竹根姜抗姜瘟病过程中的上下游关系及其对木质素合成的影响，有望解决MeJA诱导竹根姜抗病机制上值得探讨和尚待明确的问题。

1 材料与方法

1.1 材 料

姜瘟病病原菌为青枯菌(Ralstoniasolanacearum)，致病性姜青枯菌于2013年6月自重庆市荣昌县盘龙镇三合村罹病竹根姜分离，4号生理小种，生化型为Ⅳ型，TTC培养基(蛋白胨10 g，酸水解酪蛋白1 g，葡萄糖5 g，琼脂18 g，加水至1 000 mL，pH7.0，灭菌放凉加入过滤灭菌质量分数为1%的TTC 5 mL)培养，菌悬液接种竹根姜后鉴定为致病性姜青枯菌。供试竹根姜为四川地方品种，竹根姜无菌苗由重庆文理学院陈泽雄提供，竹根姜无菌苗栽种于珍珠岩和泥炭土体积比为3∶7的基质中，温度28～30 ℃、16 h·d-1光照(2 000～3 000 lx)，相对湿度60%～80%，竹根姜生长至5～7叶时，茎基部注射接种。同时配制0.1 mmol·L-1的MeJA水溶液、0.8 mmol·L-1的H2S合成抑制剂羟胺(hydroxylamine,NH2OH)和1 mmol·L-1的H2O2清除剂抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)水溶液(均购于Sigma公司)，过滤灭菌。

1.2 姜青枯菌培养

致病性姜青枯菌在NA液体培养基上摇菌扩大培养后，配成3×108mL-1菌悬液，备用。

1.3 MeJA诱导竹根姜对姜瘟病的抗性

试验设置4组处理:①单独用MeJA喷雾处理竹根姜叶片，保湿24 h；②NH2OH喷雾处理竹根姜叶片保湿24 h后,再用MeJA喷雾处理保湿24 h；③AsA喷雾处理竹根姜叶片保湿24 h后,再用MeJA喷雾处理保湿24 h；④无菌水喷雾处理为对照。2 d后再接种致病性姜青枯菌液0.5 mL，15 d后按姜瘟病5级分级标准记载病级，计算病情指数和诱抗效果[10]，每个处理各10株，重复3次。

1.4 MeJA诱导机制研究

1.4.1 处 理 各处理同“1.3”，2 d后再接种致病性姜青枯菌液0.5 mL，分别于0、2、4、6、9、12和15 d取样竹根姜块，-80 ℃保存，备用。每个处理重复3次，以“平均值±标准误”表示。

1.4.2 H2S质量摩尔浓度测定 H2S的质量摩尔浓度测定根据Sekiya等[11]的亚甲基蓝法，在670 nm波长下测定吸光度，测定结果单位为nmol·g-1。

1.4.3 H2O2质量摩尔浓度测定 H2O2质量摩尔浓度测定按照Jiang等[12]的方法进行，测定结果单位为nmol·g-1。

1.4.4 半胱氨酸脱巯基酶活性测定 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定是通过测定半胱氨酸(含二硫苏糖醇：DTT)释放的H2S来实现的。半胱氨酸脱巯基酶活性的测定参考Riemenschneider等[13]的方法，略有改动。取0.1 g竹根姜块，加0.9 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)匀浆,离心取上清。1 mL的反应体系包括:0.4 mL 0.6 mmol·L-1半胱氨酸、0.2 mL 2.5 mmol·L-1DTT、0.3 mL 100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 9.0)和0.1 mL的上清液。加入半胱氨酸后置于37 ℃反应40 min，最后加入100 μL 30 mmol·L-1的FeCl3(溶于1.2 mol·L-1的HCl)和100 μL 30 mmol·L-1的N,N-二甲基-对苯二胺(溶于7.2 mol·L-1的HCl)终止反应。在670 nm波长下，测定吸光度，测定结果单位为nmol·g-1·min-1。

1.4.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)活性测定 参照Moerschbacher等[14]的方法提取粗酶液，略有改进。PAL活性测定参照薛应龙[15]的方法。POD活性测定参照张志良[16]的方法。

1.4.6 木质素浓度测定 木质素的提取和浓度测定按照Musel等[17]的方法，在280 nm处测定吸光度值，测定结果单位为A·g-1。

1.4.7 数据分析 应用SPSS19.0统计软件对试验数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 MeJA诱导竹根姜对姜瘟病的抗性

前期预试验结果显示，分别用MeJA、NH2OH和AsA喷雾处理后，对未接种青枯菌的竹根姜生长没有影响。用0.1 mmol·L-1的MeJA处理竹根姜幼苗后再接种青枯菌，能够显著降低病情指数(P<0.05)(表1)，提高了竹根姜的抗性。而先用NH2OH或者AsA喷雾后再用MeJA处理，竹根姜的病情指数较MeJA处理均有所上升，诱抗效果较差。

表1 MeJA诱导竹根姜对姜瘟病的抗性

注：同一列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Values followed by different letters in the same column are significantly different(P<0.05).The same as below.

2.2 H2S合成抑制剂对MeJA诱导的竹根姜H2S质量摩尔浓度及半胱氨酸脱巯基酶活性的影响

研究结果表明，0.1 mmol·L-1的MeJA可诱导竹根姜H2S质量摩尔浓度和半胱氨酸脱巯基酶活性明显上升，且在处理2 d达到最大值，其后一直保持在较高水平；NH2OH可显著抑制半胱氨酸脱巯基酶的活性，进而抑制H2S的合成(图1)。由此证明，半胱氨酸脱巯基酶参与MeJA诱导的H2S的合成。

图1 H2S合成抑制剂对MeJA诱导竹根姜H2S质量摩尔浓度及半胱氨酸脱巯基酶活性的影响

2.3 H2S合成抑制剂和H2O2清除剂对MeJA诱导竹根姜H2O2质量摩尔浓度变化的影响

如图2所示，MeJA处理的竹根姜内源H2O2质量摩尔浓度急剧升高，且始终保持在较高水平；同时，NH2OH和AsA能显著逆转MeJA诱导的竹根姜H2O2质量摩尔浓度增加。由此推测H2S介导MeJA诱导的H2O2合成。

图2 H2S合成抑制剂和H2O2清除剂对MeJA诱导竹根姜H2O2质量摩尔浓度变化的影响

2.4 H2O2清除剂对MeJA诱导的竹根姜H2S质量摩尔浓度及半胱氨酸脱巯基酶活性的影响

研究结果表明，AsA对MeJA诱导的H2S产生和半胱氨酸脱巯基酶活性的增加都没有影响(图3)。由此证明H2S可能作为H2O2的上游信号参与竹根姜对MeJA的响应。

2.5 H2S合成抑制剂和H2O2清除剂对MeJA诱导的竹根姜木质素合成相关酶活性的影响

PAL是苯丙烷类代谢途径的关键酶，参与木质素、植保素和酚类物质的合成，其活性与植物抗病性密切相关。POD在植物细胞壁的交联、木质素的合成与积累中起重要作用。

用MeJA、NH2OH和AsA处理竹根姜，15 d内木质素合成相关酶PAL和POD活性的变化如图4所示。无菌水喷雾处理的2种酶活性比较稳定，MeJA处理后PAL和POD活性在前期迅速升高，第9天达到峰值，其后一直保持在较高水平。先用NH2OH或AsA喷雾后再用MeJA处理，PAL和POD的活性接近对照，说明PAL和POD的活性受到抑制。结果表明，MeJA处理短时间提高胞内H2S和H2O2质量摩尔浓度，进而激活木质素合成相关酶基因的表达，促进木质素的合成，提高竹根姜的抗病性。NH2OH和AsA可显著抑制MeJA诱导的PAL和POD活性的增加。

2.6 MeJA、NH2OH和AsA处理后竹根姜木质素浓度的动态变化

MeJA、NH2OH和AsA处理后，竹根姜木质素浓度的变化见图5。MeJA处理的竹根姜，与对照相比木质素的积累非常明显，在第12天达到峰值，随后略微降低。NH2OH和AsA可显著抑制MeJA诱导的竹根姜木质素的合成。

图3 H2O2清除剂对MeJA诱导竹根姜H2S质量摩尔浓度及半胱氨酸脱巯基酶活性变化的影响

图4 H2S合成抑制剂和H2O2清除剂对MeJA诱导竹根姜PAL和POD活性的影响

3 讨 论

MeJA作为一种诱导因子,参与植物对病原菌的信号传递和应答反应,在植物抗病反应中有着极其重要的作用[18]。Ahn等[19]发现用0.1 mmol·L-1的MeJA可以有效提高水稻对稻瘟病菌的抗性,但有关MeJA诱导竹根姜对姜青枯菌的抗病反应，尚未有研究报道。本研究结果表明，施用0.1 mmol·L-1的MeJA能够降低竹根姜的病情指数，提高竹根姜对姜瘟病的抗性，而NH2OH和AsA会抑制MeJA诱导的抗病效果。

研究表明，植物体内含有抗病防卫基因，这些基因翻译特定的防卫蛋白，当植物体内的MeJA迅速积累达到正常水平的数十倍时，即诱导植物的抗病性反应,包括激活病程相关蛋白、促进木质素、植保素和酚类积累。进一步的研究发现，MeJA或JA需要多级信号分子传导才能充分诱导植物的抗病性反应[20]，目前已证实，H2O2和H2S是植物体内主要的两种信号传递分子。作为活性氧自由基的H2O2，可在植物受到病原菌侵染或激发子诱导时大量产生(活性氧迸发)，从而在转录和翻译水平上激活植物体内各种防卫基因的表达，进而传递诱导下游防御反应如木质素(细胞壁的强化)、植保素的合成和病程相关蛋白的积累[21]。H2S作为一种新发现的信号分子，在植物的生长发育[3]和抗病应答[8]中起重要作用。

研究表明，在植物中H2O2和H2S存在相互作用，比如在狗牙根中H2S可通过改变H2O2的水平抵御干旱胁迫[5]。那么竹根姜在抗病过程中H2O2与H2S又存在怎样的关系呢？本试验结果显示，H2S合成抑制剂NH2OH可抑制MeJA引起的H2S和H2O2质量摩尔浓度以及半胱氨酸脱巯基酶活性的增加。H2O2清除剂AsA对MeJA引起的H2S产生和半胱氨酸脱巯基酶活性的增加都没有影响，但可抑制H2O2的产生。由此证明H2S可能作为H2O2的上游信号参与竹根姜对MeJA的响应。

结果还说明，MeJA在竹根姜细胞内进行有效的信号传递，通过调控细胞内下游信号分子H2S和H2O2的水平，将抗病信号传递并放大到整个植株，进而激活木质素合成相关酶(PAL和POD)，促进木质素的合成，提高竹根姜的抗病性。目前H2S在植物生命活动中的作用机制研究刚刚开始，今后还需要提供更多的分子生物学和细胞生物学方面的证据证实其功能。

Reference：

[1] LIECHTI R,FARMER E E.The jasmonate pathway[J].Science,2002,296(5573):1649-1650.

[2] 冯远娇,王建武,苏贻娟,等.茉莉酸在玉米地上部与地下部系统性诱导防御反应中的作用[J].中国农业科学,2009,42(8):2726-2735.

FENG Y J,WANG J W,SU Y J,etal.The Role of jasmonic acid in the systemic induced defense response of aboveground and underground in corn (Zeamays) [J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(8):2726-2735 (in Chinese with English abstract).

[3] FANG T,CAO Z Y,LI J L,etal.Auxin-induced hydrogen sulfide generation is involved in lateral root formation in tomato[J].PlantPhysiologyBiochemistry,2014,76(5):44-51.

[4] SHAN C,LIU H,ZHAO L,etal.Effects of exogenous hydrogen sulfide on the redox states of ascorbate and glutathione in maize leaves under salt stress[J].BiologiaPlantarum,2014,58(1):169-173.

[5] SHI H,YE T,CHAN Z.Exogenous application of hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide enhanced multiple abiotic stress tolerance in bermudagrass (Cynodondactylon(L).Pers.)[J].PlantPhysiologyBiochemistry,2013,71(2):226-234.

[6] LI Z G,LONG W B,YANG S Z,etal.Involvement of sulfhydryl compounds and antioxidant enzymes in H2S-induced heat tolerance in tobacco (NicotianatabacumL.) suspension-cultured cells[J].InVitroCellularDevelopmentalBiology-Plant,2015,51(4):1-10.

[7] PAPENBROCK J,RIEMENSCHNEIDER A,KAMP A,etal.Characterization of cysteine-degrading and H2S-releasing enzymes of higher plants-from the field to the test tube and back[J].PlantBiology,2007,9(5):582-588.

[8] LI Z G.Hydrogen sulffde:a multifunctional gaseous molecule in plants[J].RussianJournalPlantPhysiology,2013,60(6):733-740.

[9] 周大祥,熊 书.外源茉莉酸甲酯诱导竹根姜对青枯菌的抗性[J].西北植物学报,2015,35(7):1415-1420.

ZHOU D X,XIONG SH.Resistance of ‘Zhugenjiang’ ginger(ZingiberofficinaleRoscoe) toRalstoniasolanacearuminduced by exogenous methyl jasmonate[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2015,35(7):1415-1420(in Chinese with English abstract).

[10] HE L Y,SEQUEIRA L,KELMAN A.Characteristics of strains ofPseudomonassolanaeearumfrom China[J].PlantDisease,1983,67(12):1357-1361.

[11] SEKIYA J,SCHMIDT A,WILSON L G,etal.Emission of hydrogen sulfide by leaf tissue in response to L-cysteine[J].PlantPhysiology,1982,70(2):430-436.

[12] JIANG M Y,ZHANG J H.Water stress-induced abscisic acid accumulation triggers the increased generation of reactive oxygen species and up-regulates the activities of antioxidant enzymes in maize leaves[J].JournalofExperimentalBotany,2002,53(379):2401-2410.

[13] RIEMENSCHNEIDER A,NIKIFOROVA V,HOEFGEN R,etal.Impact of elevated H2S on metabolite levels,activity of enzymes and expression of genes involved in cysteine metabolism[J].PlantPhysiologyBiochemistry,2005,43(5):473-483.

[14] MOERSCHBACHER B,HECK B,KOGEL K H.An elicitor of the hypersensitive lignification response in wheat leaves isolated from the rust fungusPucciniagraminisf.sp.tritici.induction of enzymes correlated with biosynthesis of lignin[J].ZeitschriftfurNaturforsch,1986,41(5):839-844.

[15] 薛应龙.植物生理学实验[M].北京:高等教育出版社,1990:121-124.

XUE Y L.Plant Physiology Experiment[M].Beijing:Higher Education Press,1990:121-124(in Chinese).

[16] 张志良.植物生理学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2005:31-33.

ZHANG ZH L.The Guidance of Plant Physiology Experiment[M].Beijing:Higher Education Press,2005:31-33(in Chinese).

[17] MUSEL G,SCHINDLER T,BERGFELD R.Structure and distribution of lignin in primary and secondary cell walls of maize coleoptile analyzed by chemical and immunological probes[J].Planta,1997,201(2):146-159.

[18] DURRANT W E,DONG X.System atic acquired resistance[J].AnnualReviewofPhytopathology,2004,42(1):185-209.

[19] AHN I P,KIM S,KANG S,etal.Rice defense mechanisms againstCochliobolusmiyabeanusandMagnaporthegriseaare distinct[J].Phytopathology,2005,95(11):1248-1255.

[20] VAN DER ENT S,VAN WEES S C M,PIETERSE C M J.Jasmonate signaling in plant interactions with resistance-inducing beneficial microbes[J].Phytochemistry,2009,70(13/14):1581-1588.

[21] TORRES M A.ROS in biotic interactions[J].PhysiologiaPlantarum,2010,138(4):414-429.

(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

H2S Functions an Upstream Signal before H2O2in Methyl Jasmonic-induced Resistance of ‘Zhugenjiang’ Ginger (ZingiberofficinaleRoscoe) toRalstoniasolanacearum

ZHOU Daxiang1,2and XIONG Shu3

(1.College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou Chongqing 404100, China; 2.Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation, College of Life Science, Chongqing University, Chongqing 400030, China; 3.Department of Basic Medicine, Chongqing Three Gorges Medical College, Wanzhou Chongqing 404120, China)

To explore the role of H2S and H2O2in the induced resistance of Bacterial Wilt of Ginger in ‘Zhugenjiang’ ginger with methyl jasmonate (MeJA), the seedlings of ‘Zhugenjiang’ ginger were treated with MeJA, NH2OH+MeJA, AsA+MeJA and sterile water, and incidence of disease were observed and several biological resistance components(H2S, H2O2, PAL, POD and lignin) were determined. The results showed that significantly low disease indexes of ‘Zhugenjiang’ ginger were detected in the treatment of MeJA, and the induced disease resistances of MeJA were inhibited by hydroxylamine (NH2OH) functioning as H2S synthesis inhibitor and ascorbic acid (AsA) served as H2O2scavenger. Further study showed that the synthesis of H2S (mainly be synthesized by cysteine desulfhydrase) and H2O2, the activity of cysteine desulfhydrase, the activation of lignin synthases (PAL and POD) were significantly promoted. NH2OH could reduce the activity of cysteine desulfhydrase and inhibit the synthesis of H2O2and H2S. AsA could inhibit the synthesis of H2O2, and it had no effect on the synthesis of H2S and the activity of cysteine desulfhydrase. These results indicated that H2S may play a role in the response of MeJA to disease-resistant as an upstream signal of H2O2. By regulating the levels of H2S and H2O2, MeJA can activates the activity of lignin biosynthesis enzymes, promote the synthesis of lignin, and increase resistance againstRalstoniasolanacearum.

Hydrogen sulphide; Hydrogen peroxide; Methyl jasmonate; ‘Zhugenjiang’ ginger(ZingiberofficinaleRoscoe);Ralstoniasolanacearum

ZHOU Daxiang, male,associate professor,Ph.D. Research area:plant physiology research. E-mail：675753786@qq.com

XIONG Shu,female,lecturer.Research area:plant physiology research.E-mail:dqzhou79@163.com

日期：2017-05-22

2016-03-20

2016-05-07

重庆市自然科学基金(cstc2016jcyjA2132)；重庆市教委科学技术研究项目(KJ1502601)；重庆三峡学院院级重点项目。

周大祥，男，副教授，博士，研究方向为植物生理学。E-mail：675753786@qq.com

熊 书，女，讲师，研究方向为植物生理学。E-mail:dqzhou79@163.com

Q945.79

A

1004-1389(2017)05-0775-06

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.034.html

Received 2016-03-20 Returned 2016-05-07

Foundation item The Natural Science Foundation of Chongqing(No.cstc2015jcyjA1211);Scientiffc and Technological Research Program of Chongqing Municipal Education Commission(No. KJ1502601); the Key Project of Chongqing Three Gorges University.