基于液滴技术的烟草细胞免疫应激信号的检测

苍小鑫，赵小明，钟润涛，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕

(1.中国科学院 大连化学物理研究所，辽宁大连 116023； 2.大连工业大学 食品学院，辽宁大连 116034；3.大连海事大学 环境科学与工程学院，辽宁大连 116026)

基于液滴技术的烟草细胞免疫应激信号的检测

苍小鑫1,2，赵小明1，钟润涛3，王文霞1，尹 恒1，朱靖博2，丁 燕2

(1.中国科学院 大连化学物理研究所，辽宁大连 116023； 2.大连工业大学 食品学院，辽宁大连 116034；3.大连海事大学 环境科学与工程学院，辽宁大连 116026)

基于液滴微流控芯片技术，用壳寡糖(chitosan oligosaccharide ，COS)处理悬浮培养的烟草细胞(BY-2 cell)，对烟草细胞产生的免疫应激信号分子(H2O2和Ca2+)进行荧光检测。用50 μg/mL的壳寡糖水溶液分别刺激装载过氧化氢和钙离子荧光探针的烟草细胞，在荧光显微镜下观察到烟草细胞产生的荧光；以液滴微流控芯片为实验平台，研究发现水相流速为100 μL/h，油相流速为300 μL/h时，液滴尺寸为300 μm，适合烟草细胞的包裹，在该条件下将COS与荧光探针孵育后的细胞包裹在液滴中，在荧光显微镜下观察到液滴中的荧光；后用荧光酶标仪检测96孔板和液滴承载的细胞的荧光强度，结果显示1 h内两者的变化趋势一致。试验为液滴微流控芯片在植物免疫诱导剂和生物农药方面的研究提供了参考。

液滴微流控芯片；壳寡糖；烟草细胞；H2O2荧光探针；Ca2+荧光探针

植物病毒病的防治一直是世界范围内的一个难题[1]，其中烟草病毒病危害面积广，经济损失大且难以防治[2]。虽然化学农药可以快速有效防治，保证高产，但是随之而来的农药残留高、环境污染严重和抗药性增强等问题日益增多[3]，这些问题严重威胁到人类健康。

生物农药是指直接利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂[4]。利用植物诱导抗性来开发各种生物农药是保护领域的研究热点[5-6]。寻找高效植物激发子成为研发新型生物农药的重点，20世纪90年代，中国研究者开展了寡糖激发子生物农药的研发，筛选出较有成效的生物农药之一是壳寡糖[7-8]。

钙离子是植物体内的第二信使，钙离子激发是植物抗性表达过程的早期反应之一，植物能够利用钙离子浓度变化感受外界刺激。H2O2也是植物防御反应的早期信号分子，是植物防御反应的标志，研究发现植物体受病原菌侵害和逆境胁迫过程中，会爆发大量的H2O2，它可以穿过细胞膜直接进行信号传递。

ZHAO等[9]将烟草叶片装载NO和H2O2荧光探针后，利用荧光显微镜并在激发光为488 nm，发射光为505～530 nm时检测到烟草叶片产生的荧光信号，证实壳寡糖诱导烟草细胞抗病的能力。LU等[10]为证明壳寡糖对烟草花叶病毒的作用效果，将4～6叶期的烟草叶片装载Ca2+探针，经壳寡糖处理后，在荧光显微镜下观察到叶片中产生的荧光，并对钙离子浓度变化进行检测。ZHANG等[11]利用荧光酶标仪检测装载了NO、Ca2+、H2O2荧光探针的悬浮培养的烟草细胞，检测不同浓度的壳寡糖处理后，烟草细胞中各种诱导因子的变化。

微流控技术是一种利用微流体力学，把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、培养、反应、分离、检测等操作单元高度集成[12]，用以实现各种生物或化学试验的技术，具有高通量、高灵敏度、低试剂量消耗、无交叉污染、反应速度快的优点[13]。其中的液滴微流控技术以离散的微小液滴为流动主体，每一个形态稳定的液滴均可视为独立的微反应器，减少了交叉污染，且便于操控，因此是单细胞分析[14]、分子生物学[15]、药物分选[16-17]、材料合成[18-19]等领域的理想选择。利用液滴微流控技术的上述优势，将植物细胞包裹到含有荧光探针和待考察的植物激发子的液滴中，检测并比较不同种类待考察的植物激发子诱导植物细胞产生H2O2和Ca2+等植物抗性相关信号分子的能力[9-11,20]。

为研究将微流控液滴技术应用于植物免疫诱导剂荧光信号检测的可行性，本试验摸索了使用微流控芯片生成包裹烟草细胞所需要的流体力学参数，并对经壳寡糖刺激后的烟草细胞液滴进行荧光检测，采用荧光酶标仪在1 h内对液滴中烟草细胞和96孔板中细胞的荧光变化趋势进行对比，为基于液滴微流控芯片的植物免疫诱导剂和生物农药的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

KW-4A型匀胶机：美国Chemat公司；EH20A plus热板：美国Lab Tech公司；URE-2000/35型紫外深度光刻机：中国科学院光电技术研究所；PDC-32G-2等离子体清洗器：美国Harrick公司；IX73荧光倒置显微镜：日本Olympus公司；Image-Pro Plus图片处理软件：美国Media Cybernetics公司；TJ-2A注射泵：保定兰格恒流泵有限公司；Gemini EM荧光酶标仪：美国分子仪器公司；752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；CR21N离心机：日本日立公司。

液滴形成油：美国Biorad公司；Sylgard184聚二甲基硅氧烷：Polydimethylsiloxane，美国Dow Corning公司；SU-83035光刻胶：美国Micro Chem公司；乳酸乙酯：天津市光复精细化工研究所；异丙醇：天津博迪化工有限公司；浓H2SO4、H2O2：天津市科密欧；苋菜红：上海Aladdin公司；三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷：美国sigma公司；FC-40油：美国Santa Cruz公司； KOH、KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4：均为国产分析级纯；过氧化氢荧光探针(H2DCF-DA)：美国Sigma公司；钙离子荧光探针(Fluo-3AM)：上海碧云天生物技术有限公司；壳寡糖由大连中科格莱克生物科技有限公司制备，脱乙酰度>95%，聚合度2～10；BY-2烟草细胞：中国科学院大连化学物理研究所天然产物与糖工程研究课题组提供。

1.2 PDMS液滴微流控芯片制备

芯片模板采用标准软刻蚀工艺加工[21]。SU-8玻璃模板的制作：在H2SO4-H2O2中清洗过的 70 mm×70 mm 玻璃基片以第一转速为500 r/min，10 s；第二转速为960 r/min，30 s 的速率旋涂SU-83035光刻胶，经过加热前烘后，利用曝光成像将掩膜上的图案设计刻录到光刻胶上，再将刻录有图案的光刻胶玻璃基片放在95 ℃的热板上加热烘烤，冷却到25 ℃后，在乳酸乙酯中显影，用异丙醇淋洗干净，转移至热板180 ℃坚膜，冷却至25 ℃；PDMS芯片浇注成型：将PDMS预聚液与固化剂按体积比10∶1混合均匀，倒入SU-8模板，利用真空泵抽走小气泡，80 ℃固化成型后揭下，切割、打孔，与涂有PDMS的载玻片在等离子腔内照射，取出，迅速封接，随后在80 ℃烘箱加固封接。

1.3 苋菜红液滴的制备及液滴大小的测定

试验采用流动共聚焦[17]的PDMS芯片形成油包水的液滴(芯片结构见图1)，油相为液滴形成油，水相为饱和的苋菜红水溶液。使用注射泵调节流体的速率(水相流速为100 μL/h，油相流速分别为200、300、400、500、600 μL/h；油相流速为600 μL/h，水相流速分别为500、400、300、200、100 μL/h)。在某一固定的水相和油相流速下，利用显微镜图像处理软件随机拍摄10个视野，每个视野约10个液滴，测定这100个液滴的直径并取平均值，获得该流速下液滴的尺寸。

1.4 液滴制备前细胞的处理

取处于对数生长期的悬浮培养的BY-2细胞100 mL，先经80目镍丝网过滤，再将滤液经300目镍丝网过滤，所得滤液于50 mL离心管中，1 000 r/min、5 min，25 ℃条件下离心，离心后去除上清液余留2 mL，备用。

1.5 H2DCF-DA 探针的孵育及壳寡糖的诱导

取“1.4”中的BY-2悬浮细胞2 mL加入10 mL离心管中，然后加入1 μL 2 mmol/L H2DCF-DA荧光探针，室温120 r/min黑暗孵育1 h后，加入3 mL新鲜的培养基，黑暗条件下，25 ℃、120 r/min孵育30 min，然后将细胞混匀后加入到6孔板中，每孔1 mL细胞悬液，用荧光显微镜观测H2O2的产生情况(激发波长504 nm；发射波长529 nm)，以50 μg/mL质量浓度壳寡糖处理孵育探针的细胞后，用荧光显微观察烟草细胞荧光产生情况。 1.6 H2O2信号分子液滴的制备及荧光强度的检测

结合操作“1.3”液滴的生成和“1.5”探针的装载及诱导，将过氧化氢探针孵育并受到壳寡糖预处理后的细胞微液滴在荧光显微镜下观察，对其观察到的荧光强弱的差别给予评价。将经壳寡糖诱导后的孵育H2DCF-DA的烟草细胞和液滴中的细胞置于黑色96孔板中，利用荧光酶标仪对其1 h内的荧光强度变化进行测定并对比。

1.7 Fluo-3AM 探针的孵育及壳寡糖的诱导

钙离子荧光探针的孵育及壳寡糖诱导试验的具体操作同“1.5”。1.8 Ca2+信号分子液滴的制备及荧光强度的检测

钙离子信号分子液滴的制备及荧光强度检测的具体操作同“1.6”。

2 结果与分析

2.1 液滴生成芯片设计

应用带有通道汇流结构区域的微流控芯片以制备微液滴。通过显微镜观察发现，悬浮培养的烟草细胞其直径为60～240 μm，考虑到悬浮培养的烟草细胞易于成团生长，较大的微流控通道宽度不易造成通道阻塞，因此将芯片的通道宽度设定为350 μm；液滴生成区域的通道宽度设定为250 μm；通道加工深度为120 μm(图1)。油相注入到芯片后，细胞悬液被油相在十字型汇流缩口处被油相的剪切力夹断，形成连续的液滴。

A.芯片掩膜 Photomask of chip；B.芯片示意图 Schematic plot of chip

2.2 液滴大小的确定

对于通道宽度和高度已确定的芯片，可以通过调节油相和水相的流速来控制液滴的大小。以溶有苋菜红染料的水相进行液滴生成模拟试验，首先将苋菜红水溶液流量固定为100 μL/h，调节油相流速，分别为600、500、400、300、200 μL/h；再将油相流量固定为600 μL/h，调节水相流速，分别为500、400、300、200、100 μL/h。利用显微镜成像处理系统对10个条件下液滴的大小进行测量，每个条件下测量10个液滴的直径取平均值作为该条件下液滴的大小，制作出如图2所示的统计图。由于悬浮培养的烟草细胞易成团，通过测量单个形状规则的烟草细胞的大小约为60 μm，而成团的烟草细胞可达到280～300 μm，因此本试验需液滴大小为300 μm左右。通过图2中的数据分析可以得出，当水相为100 μL/h，油相为300 μL/h时，生成的液滴大小最适合BY-2烟草细胞的包裹。

2.3 壳寡糖诱导烟草细胞中H2O2的产生及荧光检测

将H2DCF-DA探针孵育到BY-2烟草细胞中，并用50 μg/mL的壳寡糖水溶液进行诱导。前期的试验已证明50 μg/mL的壳寡糖的诱导烟草植株抗病效果较好[9]，可以显著激发植物细胞产生免疫信号分子。因此，本研究以50 μg/mL的壳寡糖处理烟草细胞时过氧化氢的产生情况为研究模型，考察细胞经壳寡糖处理后产生的荧光情况，结果见图3。

2.4 液滴中H2O2信号分子荧光的检测

将BY-2细胞悬液经过H2O2探针孵育并使用50 μg/mL壳寡糖诱导后，包裹于微液滴中，在荧光显微镜下进行观测，结果见图4。图4显示，微液滴包裹的细胞经探针孵育并受到激发子的诱导作用后，其产生的H2O2与探针结合，在激发光源的作用下可以发射出明显的荧光。

2.5 微液滴与96孔板中BY-2细胞受壳寡糖诱导后的荧光对比

将经过50 μg/mL壳寡糖刺激后的BY-2细胞分别包裹于液滴并置于黑色96孔板中，利用荧光酶标仪检测各自荧光强度的变化趋势。图5显示，1 h内两者的变化趋势基本一致。

图2 液滴大小与流速的关系

图3 明场和荧光场下BY-2细胞产生荧光的情况

2.6 壳寡糖诱导烟草细胞中Ca2+的产生及荧光检测

将Fluo-3AM探针孵育到BY-2烟草细胞中，并用50 μg/mL的壳寡糖水溶液进行诱导激发植物细胞产生钙离子信号分子。结果如图6所示，壳寡糖预处理后的装载钙离子荧光探针的烟草细胞在显微镜下可以观察到荧光，而未经壳寡糖处理的烟草细胞未观察到荧光。

2.7 液滴中Ca2+信号分子荧光的检测

将BY-2细胞悬液经过Ca2+探针孵育并使用50 μg/mL壳寡糖诱导后，包裹于微液滴中，在荧光显微镜下进行观测，如图7所示。经过Ca2+探针孵育而未经壳寡糖预处理的细胞在激发光源的激发下，没有显示出荧光；而经Ca2+探针孵育并接受壳寡糖预处理后的细胞，在激发光源的作用下，发射出了荧光。结果显示，微液滴包裹的细胞经探针孵育并受到激发子的诱导作用后，其产生的Ca2+与探针结合，在激发光源的作用下可以发射出荧光。

A.未加入过氧化氢探针与壳寡糖的单细胞液滴 Fluorescence of cells in droplets (H2DCF-DA-/ oligosaccharide-)； B.加入过氧化氢探针而未加入壳寡糖的单细胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(H2DCF-DA+/oligosaccharide-)； C.加入过氧化氢探针和壳寡糖的单细胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(H2DCF-DA + / oligosaccharide +)

图5 BY-2细胞经壳寡糖刺激后在微液滴和96孔板中产生荧光的强度对比

2.8 微液滴与96孔板中BY-2细胞受壳寡糖诱导后的荧光对比

将经过50 μg/mL壳寡糖刺激后的BY-2细胞分别包裹在液滴中和置于黑色96孔板中，利用荧光酶标仪检测各自荧光强度的变化趋势。图8显示，1 h内两者的变化趋势基本一致。

3 结论与展望

本研究探索利用微流控芯片液滴技术包裹植物细胞的条件，在细胞悬液流速为100 μL/h，油相流速为300 μL/h的条件下生成直径为300 μm左右的液滴，成功得到包裹烟草细胞的微液滴。并用50 μg/mL壳寡糖水溶液诱导孵育H2DCF-DA和Fluo-3AM荧光探针的细胞发生免疫应激反应，利用荧光显微镜检测得到细胞受激发产生的荧光，并将液滴中受壳寡糖诱导的细胞和96孔板中受相同处理的细胞荧光对比，发现微液滴中的BY-2细胞与96孔板中的细胞荧光强度变化趋势相同，说明微液滴包裹植物细胞在荧光检测的角度与传统的孔板检测结果具有一致性。

每一个液滴都是一个微小的环境，液滴内的细胞可以和激发子快速均匀地混合，且能够依次均匀地分布在孔板内，而在96孔板的一个孔内，以悬浮液存在的细胞会随着时间延长而发生聚集的现象，使其在孔板内分布不均匀，因此当荧光酶标仪的光束均匀地透过孔板时，由于液滴分布均匀，检测光束均匀地照射孔中的细胞，而以细胞悬液形式存在的孔，因为细胞聚集成团，使检测光束不能均匀完整地照射到所有细胞，因此液滴包裹的细胞的荧光会强于孔板内只含有细胞的荧光强度，灵敏度更高。虽然存在检测灵敏度的不同，但两者的效应机制相同，所以荧光变化的趋势一致。由此可见，液滴微流控芯片可以用来做壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测试验，且相比96孔板具有更高的灵敏度，是一个更有优势的试验分析载体。

微液滴包裹植物细胞进行荧光检测，为植物免疫应激信号分子的检测提供了一个全新的方法，也为烟草等植物细胞的研究提供了一个具有优势的平台。但本技术现阶段还缺少完善的商品化仪器设备，构建微液滴分析平台需要较多的人力和物力投入，需要具有微液滴专业知识的人员进行平台的构建，这限制本技术的应用发展。随着微流控技术的发展和市场化的不断推进，基于液滴技术的植物细胞免疫应激信号检测技术必将迅速发展，推动植物单细胞分析领域的研究进步。

图6 明场和荧光场下BY-2细胞产生荧光的情况

A.加入钙离子探针而未加入壳寡糖的单细胞液滴 Fluorescence of cells in droplets (Fluo-3AM+/oligosaccharide-)； B.加入钙离子探针和壳寡糖的单细胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(Fluo-3AM+/oligosaccharide+)

图8 BY-2细胞经壳寡糖刺激后在微液滴和96孔板中产生荧光的强度对比

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(责任编辑：潘学燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Detection of Immunological Stress Signal for BY-2 Cell Based on Droplet Microfluidic

CANG Xiaoxin1,2, ZHAO Xiaoming1,ZHONG Runtao3, WANG Wenxia1, YIN Heng1, ZHU Jingbo2and DING Yan2

(1.Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academic of Sciences, Dalian Liaoning 116023, China; 2.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian Liaoning 116034, China; 3.School of Environmental Science and Engineering, Dalian Maritime University, Dalian Liaoning 116026, China )

Based on droplet microfluidics technology, we detected immunological stress singling molecules (H2O2and Ca2+) secreted by BY-2 cells under simulation of chitosan oligosaccharide (COS) in the paper.BY-2 cells labeled with H2DCF-DA and Fluo-3AM were stimulated by 50 μg/mL COS solution, and fluorescence was detected.We optimized our parameters for this droplet microfluidics platform and could achieve ideal encapsulation of BY-2 cells at an aqueous phase flow rate of 100 μL/h, an oil phase flow rate of 300 μL/h, and a droplet diameter of 300 μm.Under the optimized conditions, COS and fluorescence-labeled BY-2 cells encapsulated in droplets and fluorescence was observed.Then the fluorescence intensity of droplet-encapsulated BY-2 cells were measured by microplate reader and the unencapsulated cells in 96-well plate were taken as the control group.The results indicated that within 1 h, the trend of the intensity changed similarly, and this could provide the guidance for microfluidics-based research in plant immune inducer and biopesticides.

Droplet microfluidic; Chitosan oligosaccharide; BY-2 cell; H2DCF-DA; Fluo-3AM

CANG Xiaoxin, female, master student.Research area:plant protection.E-mail:iceycang@foxmail.com

ZHAO Xiaoming, male, research fellow, doctoral supervisor.Research area:plant sugar biology.E-mail: zhaoxm@dicp.ac.cn

日期：2017-05-22

2016-12-20

2017-01-10

国家自然科学基金(31370391)；中国科学院科技服务网络计划(STS计划)(KFJ-SW-STS-143)。

苍小鑫，女，硕士研究生，从事液滴微流控芯片的研究。E-mail:iceycang@foxmail.com

赵小明，男，研究员，博士生导师，主要从事植物糖生物学的研究。E-mail: zhaoxm@dicp.ac.cn 丁 燕，女，讲师，硕士生导师，主要从事天然产物的研究。E-mail:dingyan_515@hotmail.com

S-3

A

1004-1389(2017)05-0759-08

DING Yan, female, lecturer, master supervisor.Research area:chemistry of natural product.E-mail:dingyan_515@hotmail.com

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.030.html

Received 2016-12-20 Returned 2017-01-10

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31370391); Program of Science and Technology Service Network Initiative(No.KFJ-SW-STS-143).