碱法提取款冬花渣多糖工艺的响应面法优化

宋逍++赵鹏

[摘要] 目的 优化款冬花渣多糖碱法提取工艺条件。 方法 通过响应面法，以多糖提取率为评价指标，分别以pH、温度、时间为考察条件，探讨其对款冬花渣多糖提取的影响。 结果 pH值为9.5，温度为61℃，时间85 min，加入20倍量的水（mL/g），为最最优工艺条件，在此工艺条件下，款冬花渣多糖的提取率为4.211%，多糖含量为6.93%。 结论 碱法提取款冬花渣多糖具有提取率高的优点。

[关键词] 款冬花渣；多糖；碱提取；响应面

[中图分类号] R283.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（a）-0017-04

Optimization of extraction of polysaccharides from Tussilagofarfara wasteby basic extraction

SONG Xiao ZHAO Peng

School of Pharmacy， Shaan Xi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712046， China

[Abstract] Objective To study the optimum extraction of polysaccharide from Tussilagofarfara waste. Methods Response surface methodology was used to optimize the extraction process for Tussilagofarfara waste. The effect of time， pH and temperature were addressed using response surface methodology. Results The optimal extraction conditions were determined as follows： pH of 9.5， temperature of 61℃， time of 85 min， and material-to-liquid ratio of 20 （mL/g）. Under these conditions， the extraction yield of polysaccharide was 4.211%， the content of 6.93%. Conclusion This method is suitable for the base extraction of polysaccharide from Tussilagofarfara waste.

[Key words] Tussilagofarfara waste； Polysaccharides； Basic extraction； Response surface methodology

款冬花是我国常用中药，具有润肺止咳、化痰平喘之功效，常用來治疗慢性支气管炎（气管炎）、咳嗽气喘等疾病，分布于陕西、宁夏、河北、甘肃等地[1]。每年在实际生产中有大量款冬花被提取黄酮后，药渣作为废弃物被丢弃，造成了款冬花药材的大量浪费。现有文献和本课题组长期研究证明，款冬花药渣中的多糖具有抗人白血病细胞K562及其他肿瘤的作用[2-4]。目前对款冬花多糖的提取工艺报道较少，主要是传统的热水提取法[5]，或超声提取等方法[6]，由于酸性多糖和高分子量的多糖较难溶于水，因而碱水提取可有效提高多糖的提取率[7-12]。基于此，本文以款冬花药渣为研究对象，考察款冬花渣多糖碱提取中碱的用量、液料比、温度等因素对提取率的影响，并通过响应面法[13-19]筛选款冬花渣多糖碱法提取最佳工艺，为其后续合理开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所用款冬花药材购于西安万寿路中药材批发市场，经陕西中医药大学王昌利教授鉴定为菊科植物款冬（Tussilagofarfara）的干燥花蕾，款冬花渣为本实验室提取款冬花黄酮后的剩余物经干燥所得；Na2CO3、CH3CH2OH、CH3CH2OCH2CH3、CH3COCH3、C6H12O6 及其他试剂均为国产分析纯。

UV-2501PC紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）；FA2004电子天平（上海精科天平厂）；H2050R台式离心机（湖南湘仪公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 款冬花渣多糖的碱提取方法 将干燥的款冬花药渣粉碎，过60目筛。过筛后的款冬花药渣按照一定的料液比加水，加热至一定温度，加入一定量的碳酸钠调节pH，提取一定时间，过滤，滤液按生药体积比1∶1浓缩，浓缩液加无水乙醇至终浓度为80%，静置过夜后抽滤，真空干燥滤饼，可得款冬花粗多糖。

称取一定量的款冬花药渣，加入10倍量的水，在40℃，60 min下，考察不同pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）对多糖提取率的影响；其他条件不变，考察不同温度（40、50、60、70、80℃）对多糖提取率的影响；其他条件不变，考察不同时间（60、70、80、90、100 min）对多糖提取率的影响；其他条件不变，考察不同水料比（10、15、20、25、30 mL/g）对多糖提取率的影响。

通过单因素实验选择pH值、温度、时间等3个因素，用响应面法进行最佳工艺筛选试验。见表1。

1.2.2 多糖含量及提取率的测定方法 按照文献[20]报道的方法，精密称取葡萄糖对照品100 mg，用蒸馏水溶解定容在100 mL容量瓶中，摇匀，即得葡萄糖标准溶液。分别精密吸取葡萄糖标准溶液10、20、40、60、80、100 μL置于具塞量筒中，分别加蒸馏水至2.0 mL，随后分别加入苯酚的新蒸溶液1.0 mL，摇匀，同时分别快速加入浓硫酸5.0 mL摇匀，然后放置5 min，再用沸水浴加热15 min，取出放冷至室温；另取分别加过苯酚和浓硫酸的蒸馏水2.0 mL，按上述方法制备空白对照，于波长490 nm处测定吸光度，对以上数据进行回归处理，经计算后得到校准曲线方程：y=1.025x+0.0383，相关系数r=0.9993，浓度范围在0.01～0.1 mg/mL，线性良好。

精密称量实验所得粗多糖干燥品20 mg，置于100 mL的容量瓶中，先用少量蒸馏水溶解后继续加水至刻度线，精密移取所配溶液0.2 mL，照前文方法操作得出其吸光度，用标准曲线方程算出粗多糖的百分含量，再由公式（1）算出多糖的提取率。

多糖提取率=（款冬花粗多糖×多糖含量/款冬花药渣干重）×100%。 （1）

2 结果与讨论

2.1 不同提取条件下单因素实验结果

当提取液的pH值为9.5时，可以将多糖最大化地提取出来，所以选择pH值为9.5作为最优的提取pH值（图1）。低于60℃时，随提取温度升高，提取率逐渐升高，超过60℃后，提取率有下降的趋势（图2）。分析原因可能是当温度不太高时，温度的升高会促进多糖从植物组织中溶出，但当温度过高时，可能会造成多糖类成分的破坏，因此选择60℃作为最适提取温度。在80 min以前，随提取时间延长，提取率逐渐升高，超过80 min后，提取率有较快的下降趋势（图3）。这可能是因为提取时间过长，造成多糖类成分破坏，因此选择80 min作为最适提取时间。不断增加提取用水量，多糖提取率会持续上升。当提取用水超过药材质量的20倍后，多糖提取率的增加趋势变小（图4）。这是因为更多的新鲜溶剂有利于有效成分的溶出，但当溶剂量达到一定水平后，多糖成分已溶出充分，因此提取率增加的趋势会逐渐变缓，所以选择最适合的水料比为20 mL/g。

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应值结果及其拟合模型 根据响应面实验，得到的试验组合与结果见表2，方差分析结果见表3。模型显著水平<0.05，所以该试验模型具有显著性。所得回归方程的线性相关系数r=0.9898（5.84/5.90）表示采用此模型预判每个试验因素水平变化带来的试验结果的变化情况的可信度较高。对款冬花药渣多糖提取率的影响pH值>提取时间>提取温度（表3）。

选择Design-Expert 7.01软件进行处理，对数据进行回归拟合后得到回归方程：Y=3.91+0.54X1+0.083X2+0.32X3+0.112X1X2-0.31X1X3+0.13X2X3-0.51X12-0.32X22-0.22X32。 （2）

2.2.2响应面实验所得各图分析 响应面法筛选的各因素影响图可以直观地反映款冬花多糖提取影响的主要因素，各因素交互影响的三维响应面图形见图6～8。变化最為剧烈的是pH曲线，说明pH的变化最能影响试验结果的变化；其次是时间曲线，说明此因素随着水平的改变，造成的试验结果的变化相对不太剧烈；变化最不明显的是温度曲线，表示此因素水平的变化，对试验结果所造成的影响最不明显，以上结论与表3中所示的试验数据相同。

对公式（2）求一阶偏倒数，使之等于零[21-22]，可得：X1=0.112，X2=0.201，X3=0.542；将此三个数值再代回原式，计算后判断优化的提取条件：pH值为9.528，温度为61.01℃，时间为82.71 min，加入20倍量的水（mL/g），理论上在此优化条件下可得到的多糖提取率为4.207%。

为保证响应面法实验结果的准确可靠性，对上述优化的实验参数进行相关验证试验。为方便操作，将最优参数略微修改为：pH值为9.5，温度为61℃，时间为85 min，加入20倍量的水（mL/g），应用上述最优条件，平行处理三份样品，得到的多糖平均提取率为4.211%，多糖含量为6.93%。该结果与响应面法计算的4.207%接近，由此可知，应用响应面优化方法得到的提取参数可信、可行。为对比碱辅助法和传统提取法之间的优劣，采用同一种原料又进行了3次平行实验法，碱法提取款冬花多糖的提取率相较于水提法有了较大程度的提高（表4）。

3 结论

用碱法提取款冬花渣多糖，依据初步筛选结合Box-Behnken进行试验设计，筛选得出pH值为9.5，温度为61℃，时间85 min，加入20倍量的水（mL/g）时为最优工艺条件，在此工艺条件下，款冬花渣多糖的提取率为4.211%，多糖含量为6.93%。

通过研究可知，碱辅助法提取较水提法有较大的优势，提取时间短，且提取率较高，可提取得到部分大分子多糖和酸性多糖，所以该方法是一种较理想的提取方法。其为款冬花多糖的提取开发研究提供了一条新的实验方法，该法为款冬花多糖下一步深入研究提供了基础。

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（收稿日期：2016-08-15 本文编辑：王红双）