响应面法优化虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的匀浆提取

周军，徐雷涛，熊曼，董兰改，李湘洲,2*

(1.中南林业科技大学材料科学与工程学院；2.南方林业生态应用技术国家工程实验室，长沙410004)

响应面法优化虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的匀浆提取

周军1，徐雷涛1，熊曼1，董兰改1，李湘洲1,2*

(1.中南林业科技大学材料科学与工程学院；2.南方林业生态应用技术国家工程实验室，长沙410004)

根据虎杖(Polygonumcuspidatum)中主要活性成分虎杖苷和白黎芦醇提取过程中效率低、耗时长等问题研究了匀浆提取虎杖苷和白藜芦醇工艺。以虎杖苷和白藜芦醇的提取总得率为指标，在单因素试验的基础上，利用响应面法设计了以乙醇体积分数、匀浆时间和液料比为影响因素的试验，获得了匀浆提取虎杖苷和白藜芦醇的优化工艺为提取溶剂64%乙醇溶液，匀浆时间5 min，液料比14∶1(mL∶g)，在此条件下虎杖苷和白藜芦醇的一次提取总得率为1.830%。与超声辅助提取和浸提法相比，匀浆提取具有绿色高效、速度快、能耗低等优点，在虎杖等中药活性成分的大规模提取方面具有应用前景。

虎杖；虎杖苷；白藜芦醇；匀浆提取；响应面法

虎杖(Polygonumcuspidatum)为蓼科(Polygonaceae)虎杖属多年生草本植物，主要分布在我国华东、中南及辽宁、四川等地[1]。中药虎杖为虎杖植株的根，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰作用[2]。虎杖中主要含有蒽醌类和多酚类化合物，其中多酚类化合物白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过敏、降血脂、抗氧化等多方面药理活性[3]，广泛应用于医药、保健品、食品和化妆品等领域[4-5]。

虎杖苷是白藜芦醇的糖苷化合物，其在一定条件下可降解转化为白藜芦醇[6]。研究表明，虎杖苷在保护脑神经损伤、促进减肥、增强心脏功能及机体微循环等方面具有很好效果[7]。虎杖提取物的生产厂家主要集中在湖南、陕西、四川3省，这些企业大多以乙酸乙酯等有机溶剂采用浸提法反复抽提获得粗提物，其溶剂用量大、回收利用率低，所获得的粗提物经大孔树脂分离后得到初级产品以供出口，生产成本高且易燃易爆。

匀浆提取是生物组织通过加入溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，具有提取速度快、温度低、能耗低及目标成分得率高的特点[8-9]，近年来已应用于提取植物组织中生物碱、黄酮类、芪类[10-12]等多种功能活性成分，效果良好，但是将匀浆提取技术用于虎杖中虎杖苷和白藜芦醇提取的相关研究鲜见报道。笔者以药理作用相似而极性差异较大的虎杖苷和白藜芦醇的提取总得率为分析指标，采用响应面法优化虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的匀浆提取工艺，并与浸提、超声波辅助提取进行对比，研究适合于虎杖中主要活性成分的绿色高效提取技术，也为其他中药活性成分的提取分离提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虎杖根为3年根，产自湖南省花垣县，采收后切块自然晾干，粉碎、过40目(380 μm)标准筛后备用，其含水率为(8.67+0.07)%；98%白藜芦醇标准品(美国Sigma-aldrich公司)；99%虎杖苷标准品(上海亦瑞生物技术有限公司)；乙腈、甲醇，色谱级(国药集团化学试剂有限公司)；正己烷、石油醚、甲醇、无水乙醇和乙酸乙酯(分析纯，天津大茂试剂有限公司)。

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AUY120分析天平(日本岛津公司)；JJ-2B型组织捣碎匀浆机(转速6 000～14 000 r/min)(金坛市友联仪器研究所)；SSB-4200DTDN超声波发生器(宁波新芝生物科技有限公司)；TD5K台式离心机(长沙东旺实验仪器有限公司)101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪和SHB-III循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 匀浆提取

取定量经预处理后的虎杖样品置于匀浆提取装置中，准确加入一定配比的提取溶剂，连接装置并匀浆，按实验既定时间匀浆提取后将提取液离心[13]，取定量上层提取液旋转蒸发得浸膏，再用体积分数为35%的乙腈-水溶液定容，备用。

1.2.2 浸 提

取定量虎杖样品于锥形瓶中，按液料比20∶1(mL∶g)加入65%乙醇溶液，于50℃水浴1 h，离心，取上清液，旋转蒸发得浸膏，再用体积分数为35%的乙腈-水溶液定容，备用。

1.2.3 超声波辅助提取

取定量虎杖样品于锥形瓶中，按液料比20∶1(mL∶g)加入65%乙醇溶液，于超声提取装置中超声辅助提取1 h，离心，取上清液，旋转蒸发得浸膏，再用体积分数为35%的乙腈-水溶液定容，备用。

1.2.4 分析方法

LC-20A高效液相色谱仪，Ultimate XB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相为乙腈∶水(体积比为28∶72)，检测波长303 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，样品溶液过0.45 μm滤膜，进样量10 μL。

1.2.5 数据计算

标准曲线绘制：分别取虎杖苷和白藜芦醇标准品20.0 mg和1.5 mg于100 mL容量瓶中，用35%的乙腈-水溶液定容，制备成混合标准溶液，分别取2，4，6，8，10 μL的混合标准溶液进样，并绘制标准曲线。获得白藜芦醇标准曲线为y=9 000 000x-9 146，R2=0.998，(0.03～0.15 μg范围内线性关系良好)；虎杖苷的标准曲线为y=4 000 000x-68 279，R2=0.999，(0.4～2.0 μg范围内线性关系良好)。

虎杖苷提取得率采用以下公式计算：

白藜芦醇提取得率计算方法同上。虎杖中目标提取物提取总得率为虎杖苷和白藜芦醇提取得率之和。

2 结果与分析

2.1 匀浆提取各因素对提取得率的影响

2.1.1 溶剂类型对提取得率的影响

在匀浆时间为60 s、转速14 000 r/min、液料比10∶1(mL∶g)的条件下，分析了甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(30～60℃)和正己烷5种提取溶剂对虎杖苷及目标提取物(虎杖苷和白藜芦醇)的一次提取得率影响，结果见表1。由表1可知，提取溶剂的极性(甲醇>无水乙醇>乙酸乙酯>石油醚>正己烷)越大[14]，虎杖苷的提取得率和目标成分提取总得率越高，符合相似相容原理。其中甲醇的提取效果最好，其次为无水乙醇，但由于甲醇毒性大，不宜作为提取溶剂，而乙醇基本无毒，因此宜选择乙醇作为提取溶剂。

表1 提取溶剂类型对目标提取物提取得率的影响Table 1 Effect of different extracting solvents on yield of target extracts /%

图1 乙醇体积分数对目标提取物提取得率的影响Fig. 1 Effect of different ethanol volume fractions on yield of target extracts

2.1.2 乙醇体积分数对提取得率的影响

在匀浆时间为60 s、转速14 000 r/min、液料比10∶1(mL∶g)条件下，分析不同体积分数的乙醇(50%，60%，70%，80%，90%和无水乙醇)对虎杖苷及目标提取物(虎杖苷和白藜芦醇)一次提取得率的影响，结果见图1。随乙醇体积分数的增加，提取溶剂极性减小，而虎杖苷提取得率和目标成分提取总得率随体积分数的增大而升高，60%和70%的乙醇提取条件下，虎杖苷提取得率和提取总得率分别达到最高，之后均降低，这可能是由于植物组织在较高体积分数的乙醇-水体系中不易溶胀，影响了溶剂的扩散，导致其提取率降低[15]。同时虎杖苷的极性大于白藜芦醇，根据相似相容原理，在极性更大的60%乙醇溶剂中，虎杖苷的相容性较好，其提取得率也较高。考虑到总体提取效果，宜选择体积分数70%的乙醇作为提取溶剂。

2.1.3 匀浆转速对提取总得率的影响

在乙醇体积分数为70%、液料比10∶1(mL∶g)、匀浆时间为60 s的条件下，分析不同转速(6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 r/min)对虎杖苷及目标提取物(虎杖苷和白藜芦醇)一次提取得率的影响，结果见图2。匀浆提取时转速越大，同条件下活性成分的扩散速度越快，因而提取得率也越高。由于仪器性能的限制，本研究选择最大转速14 000 r/min为匀浆转速。

图2 转速对目标提取物提取得率的影响Fig. 2 Effect of different rotate speeds on yield of target extracts

2.1.4 匀浆时间对提取总得率的影响

在乙醇体积分数为70%、转速14 000 r/min、液料比10∶1(mL∶g)条件下，分析不同匀浆时间(30，60，120，180和300 s)对虎杖苷及目标提取物(虎杖苷和白藜芦醇)一次提取得率的影响，结果见图3。匀浆提取时间越长，目标提取物提取得率越高，匀浆提取100 s内，虎杖苷提取得率和目标提取物总得率呈快速上升趋势，至300 s后提取得率虽有提高，但已不明显，因而宜选择匀浆提取时间为300 s。

图3 匀浆时间对目标提取物提取得率的影响Fig. 3 Effect of different extracting time on yield of target extracts

2.1.5 匀浆液料比对提取总得率的影响

在乙醇体积分数为70%、转速14 000 r/min、匀浆时间为300 s条件下，分析不同液料比(8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1和18∶1(mL∶g))对虎杖苷及目标提取物(虎杖苷和白藜芦醇)一次提取得率的影响，结果见图4。当液料比低于12∶1(mL∶g)时，活性成分的提取得率随液料比的增加呈快速上升趋势，之后逐渐趋于平稳。液料比过大，提取得率随之变化不大，反而增加成本，同时导致溶剂回收量加大，因此，宜选择12∶1～14∶1(mL∶g)为匀浆提取液料比。

图4 液料比对目标提取物提取得率的影响Fig. 4 Effect of different ratios of liquid to solid on yield of target extracts

2.2 响应面法优化提取工艺

由单因素试验可知，各因素对虎杖苷提取得率和活性成分提取总得率的影响基本一致，因此，在响应面试验中，选择以活性成分提取总得率为指标，乙醇体积分数、匀浆时间和液料比为影响因素，利用Design-Expert 8.0.5b中Box-Behnken试验设计了三因素三水平的响应面试验，因素水平表和试验结果分别见表2和表3。

表2 因素水平表Table 2 Factor levels

表3 Box-Behnken试验设计结果Table 3 Results of Box-Behnken experimental design

对表3中的数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程为：Y= -8.263 06+0.257 15A+0.157 75B+0.214 75C-3.625×10-3AB-2.5×10-4AC+0.026 25BC-1.847 5×10-3A2-0.026 187B2-0.011 813C2

式中：Y为虎杖苷和白藜芦醇的提取总得率，%；A为乙醇体积分数，%；B为匀浆时间，min；C为液料比，mL∶g。

由多项式的系数可知，匀浆提取工艺中各影响因素的顺序为：乙醇体积分数>液料比>匀浆时间。响应面优化工艺的方差分析结果见表4。该模型的P≤0.05，失拟项的P≥0.05，说明回归方程对试验拟合效果较好、误差较小，因而在此试验范围内可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。模型中A、B、AB、BC、A2、B2和C2项对应的P值均小于0.05，说明其对活性成分提取总得率均有显著影响，其他因素均不显著。

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

A和B、B和C因素间的交互作用见图5。A和B、C之间对提取总得率的影响并非简单的线性关系，而存在较强的交互作用。软件分析模型的结果表明，在乙醇体积分数63.73%，匀浆时间5 min，液料比13.97∶1(mL∶g)条件下，模型预测值为1.90%。在实际操作条件下(乙醇体积分数为64%，匀浆时间为5 min，液料比为14∶1(mL∶g))进行验证，3次验证结果分别为1.848%，1.810%和1.832%，均与模型预测值接近，说明该模型拟合效果较好。

图5 各因素间交互作用的等高线图Fig. 5 Plots depicting interaction between different factors

2.3 3种不同提取方法比较

对比研究了匀浆提取、浸渍提取和超声波辅助3种方法对虎杖苷和白藜芦醇的提取效果，结果见表5。由表5可见，匀浆提取法与其他两种提取方法相比，匀浆提取时间仅需5 min，目标提取物的一次提取总得率达到1.830%。与浸提法相比，提取总得率提高了0.855%；与超声波辅助提取法相比，其总得率提高了0.455%。匀浆提取法具有提取速度快、溶剂用量少、不需要加热及提取得率高等优点。

表5 虎杖苷和白藜芦醇不同提取方法比较Table 5 Comparison of different extraction methods used to extract polydatin and resveratrol

3 结 论

利用匀浆法提取虎杖中主要活性成分虎杖苷和白藜芦醇，研究了提取溶剂、匀浆转速、匀浆时间和液料比对主要活性成分提取得率的影响，并采用响应面法优化其提取工艺，获得了优化工艺为提取溶剂64%乙醇溶液，匀浆时间5 min，液料比14∶1(mL∶g)，在此条件下虎杖苷和白藜芦醇的一次提取总得率为1.830%。与超声辅助提取和浸提法相比，匀浆提取法具有提取速度快、溶剂用量少、能耗低以及目标活性物提取得率高等显著优势，在虎杖等中药活性成分的高效提取方面具有较好工业化应用前景。由于产地、采挖时间、前处理方式等因素对虎杖主要活性成分的提取得率影响较大，这些因素的影响作用以及匀浆提取过程中的传质机理均有待进一步深入研究。

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Optimization on homogenate extraction of polydatin and resveratrol fromPolygonumcuspidatumby response surface methodology

ZHOU Jun1, XU Leitao1, XIONG Man1, DONG Langai1, LI Xiangzhou1,2*

(1. College of Material Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology;2. State Engineering Laboratory of Ecological Applied Technology in Forest Area of South China, Changsha 410004, China)

As a traditional herbal medicine in China, tigen stick (Polygonumcuspidatum) has the effects of damp-inhibiting and wind-dispersing relieving, relieving cough and reducing sputum. Polydatin and resveratrol are the main bioactive constituents inP.cuspidatum. Polydatin is the precursor compound of resveratrol, and it can promote weight loss, provoke appetite in low-income mothers with young kids and enhance heart function and microcirculation, etc. Resveratrol is widely used in health-care products, cosmetics and food additives due to its antioxidant capacity, anti-inflammatory, anti-cancer and other various pharmaceutical properties. However, the extraction efficiency of resveratrol and polydatin are relatively low, so the study on the rapid and efficient method of extraction is necessary. Homogenate can improve pulverization efficiency because of powerful mechanical forces and liquid shearing forces. In addition, it can also homogenate with solvent thoroughly and promote solvent disperse into the inner part of solid phase easily. Therefore, the homogenate technique was used to extract polydatin and resveratrol fromP.cuspidatumin this study. Total extraction yield of polydatin and resveratrol was used as indicator. On the basis of singer factor experiment, the influence of ethanol volume fraction, extracting time and liquid-solid ratio on the total yield of polydatin and resveratrol were investigated by using Box-Behnken central composite design. The optimized extracting conditions were as follows: extracting solvent of 64% ethanol solution, extracting time of 5 min, liquid-solid ratio of 14∶1 (mL∶g). Under the optimized conditions, the measured yield of targets was 1.83%. Compared to the ultrasonic assisted extraction and soaking extraction method, homogenate technique could have prospects for industrial scale-up applications in active ingredients extraction fromP.cuspidatumand other Chinese herbal medicine, with the advantages of potential eco-friendly, higher efficiency and low energy consumption and so on.

Polygonumcuspidatum; polydatin; resveratrol; homogenate extraction; response surface methodology

2016-10-10

2016-12-29

“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0600805)；2016年中南林业科技大学大学生研究性学习和创新性实验项目。

周军，男，助教，研究方向为天然产物化学与利用。通信作者：李湘洲，女，教授。E-mail:rlxz@163.com

TQ461; Q946.889

A

2096-1359(2017)03-0058-06