吻合器作用下小肠组织细胞内外液变化研究

周 宇 张 宽 许晶晶 任彬彬 李博婷 宋成利

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

吻合器作用下小肠组织细胞内外液变化研究

周 宇*张 宽 许晶晶 任彬彬 李博婷 宋成利

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

明确胃肠组织在吻合器作用下的内部变化情况是吻合器工程参数优化的前提。改造直线型吻合器，嵌入检测电极；测量猪小肠在吻合器压榨作用下的多频生物阻抗，使用ColeY模型对测量结果拟合，模型参数G0、ΔG表征细胞外液、内液电导；改变垫片厚度，得到不同压榨强度下G0和ΔG的变化曲线。压榨过程分为两个阶段：第1个阶段，两个参数都迅速下降；第2个阶段，随着压榨强度的增加，G0始终保持减小趋势，ΔG由轻微波动变为轻微下降；当垫片厚度从0 mm增加至0.52 mm，ΔG和承受压强之间具有显著极相关性的样本数占总样本数的比例从40%上升至100%，而对于G0，这个比例始终为100%。结果表明：小肠在吻合器作用下，有部分组织被挤压出测量空间，引起参数迅速下降；而后，吻合器持续压榨组织，细胞外液持续排出，细胞内液在不同压榨强度下表现出不同趋势，可能和细胞的受压形变有关。该研究可为吻合器参数优化提供条件。

吻合器；压榨；ColeY模型；多频生物阻抗

引言

消化道重建是胃肠道手术的重要步骤之一。切除部分胃肠组织后，需要对剩余部分进行吻合，重新形成连续的消化道。消化道重建方法包括手工缝合和基于吻合器的机械吻合。相比手工缝合，使用吻合器具有诸多优点：缩短手术时间，提高全安性，更加适用于腹腔镜手术等[1-2]，但很难避免吻合口瘘的发生。Myers等报道的发生率为0.1%～5.3%[3]，Baker等报道的发生率为0.3%～8.3%[4]。吻合口瘘是胃肠外科吻合中最为严重的并发症，一旦发生，后果非常严重，会导致腹膜炎、形成脓疮；如果处理不善，会进一步引起脓毒病、多器官衰竭甚至死亡；即使妥善处理，病人的住院时间也会延长。研究表明，器械对组织的作用不当是引起吻合口瘘的主要原因，包括：吻合钉选取错误造成吻合器对组织的压榨过度或者压榨不够，吻合器对组织的预压榨时间不当造成吻合钉成型不佳等[3-7]。因此，一直以来，外科医生在使用吻合器时都被告知：要想获得好的吻合效果，必须正确使用吻合器。但吻合器说明书上的某些标准和主观判读以及个人经验有着紧密联系。要想掌握好吻合器的使用需要较长的学习周期，效果也因人而异[3-4,8-9]。为避免吻合器使用不当、产生吻合口瘘等并发症，必须进一步优化，实现吻合器的自动化及智能化，降低医生主观参与度，使吻合器使用更加标准化。

近些年，电动吻合器的出现使得这种优化变得更为迫切。Ethicon等把击发动作电动化[10]，而美国的电动吻合器把夹持和击发动作都电动化[11]。从规范化、一致性来讲，后者更好，因为医生在夹持过程中，用力大小和施加速度都会对组织产生不同的压榨作用，电动夹持则可以产生更加一致的压榨效果。但电动吻合器应当如何对组织进行压榨，压榨强度应该是多少，保持压榨的时间又该是多长？这些就是压榨参数的优化问题，目前对此并没有一致的认识。要想解决这些问题，首先应该清楚在压榨过程中组织内部结构到底发生了什么改变，其变化规律是优化问题的理论基础。

Chung等通过观察吻合口血流的改变，对圆形吻合器作用下的组织安全压榨限制进行了研究，得到了25%的安全压缩比率结论[12-13]。McGuire等通过测量组织受力和细胞内液的排出，研究了组织在圆形吻合器作用下所产生的压缩损伤，表明了应变引起的结构改变能够帮助定义安全的组织压缩范围,但使用钾测定法测量细胞内液的排出情况并不成功，仅通过应变响应对内部变化进行推测[14]。Morita等针对吻合器使用过程中的预压榨时间展开研究，发现预压榨可以降低组织厚度、减少出血点[15]。Myers等针对圆形吻合器，评估了组织厚度、组织压缩量、器械间隙和吻合口机械强度之间的关系，但没有考虑由组织损伤界定压缩限制[3]。Nakayama等研究了预压榨时间和吻合钉成型的关系，表明吻合钉成型和吻合口质量之间有直接关系[5-6]。目前的研究结果显示，吻合器对组织压榨时，会有液体成分排出；由于组织具有黏弹性，随着压榨参数的改变，液体排出的情况会有不同；而液体的排出和吻合钉成型之间具有相关性[5-7]。

这些结论并没有明确组织内部的具体变化情况，在液体排出过程中，细胞内液和外液如何改变，这种变化和压榨参数之间有什么关系。本研究探索在吻合器作用下组织内部变化规律，为吻合器压榨参数优化工作提供研究基础。

ColeY模型是对生物组织多频生物阻抗数据进行建模的一种常用方法，应用ColeY模型对生物组织在beta散射范围内的多频生物阻抗数据进行拟合，其优化模型参数可以直接提示生物组织的细胞内液和外液等成分[16]。该方法曾被用于人体水成分分析[17-18]，也曾被用于研究压力作用下猪脾的内部变化情况[19]。本研究对吻合器进行适当改造，在其对组织施加压榨作用的同时，对组织的多频生物阻抗进行同步测量，并使用ColeY模型分析组织内部的变化情况。

1 材料和方法

本研究设计了嵌入金电极的吻合器械夹持小肠组织，通过应变片实时压强检测，在固定时间间隔条件下，不断测量多频生物阻抗数据，并改变器械夹持的预定间隙(predetermined gap, PG)，综合分析吻合器夹持对小肠组织的影响。

1.1 实验材料

实验材料为从屠宰场获取的、刚处死猪的新鲜小肠，装在放有冰袋的保温箱内，冰袋的数量可保证箱内温度在0～4℃之间，在1～2 h之内带回实验室。先将猪小肠用0.9%的生理盐水略微冲洗肠道内部，去除粪便，剪成若干段，每段长15 cm；然后，用自制的便携式组织厚度测量仪在2 g/mm2的压强下测量每段猪小肠的厚度，挑选出厚度在0.65～0.95 mm之间的猪小肠段；再将每段猪小肠剪成3个样本，随机分入3个实验组，每个实验组的样本数为10个；最后，用浸泡过0.9%生理盐水的湿纱布覆盖猪小肠备用。

1.2 实验系统

本研究的实验系统如图1所示。

1.2.1 多频生物阻抗测量系统

多频生物阻抗测量系统由一把经过改造的吻合器和HIOKI公司的阻抗分析仪IM3570(Hioki, Nagano, 日本)组成，如图1(a)～(c)所示。对60 mm ECHELON ENDOPATH吻合器(Ethicon Endo Surgery Inc., Cincinnati, OH, USA)进行改造，仿照蓝色钉匣ECR60W (Ethicon Endo-Surgery Inc., Cincinnati, OH, USA)的外形轮廓尺寸，使用Acrylonitrile Butadiene Styrene塑料制作测量匣，其表面嵌入金电极，两个金电极相距1 cm，其后端引出导线，直接连接IM3570的探头，如图1(b)所示。图1(c)是包含了阻抗测量模块的示意图。IM3570的扫频范围为4 Hz～5 MHz，可以设置定时扫频，阻抗测量结果存储于U盘。在PC机中使用Matlab程序进行数据处理，根据实验需求开发了专用的GUI，能够以多种形式显示阻抗或者导纳测量结果，如电导-频率、电纳-频率、导纳-频率、电导-电纳等，还能够使用ColeY模型对多频生物阻抗数据进行拟合，显示拟合圆图和拟合参数等信息。

1.2.2 微型压强检测系统

基于FSR400(Interlink Electronics, California, 美国)的微型压强检测系统由FSR400、调理及供电电路、NI的DAQ数据采集卡USB-6341(NI, Texas, 美国)和PC机组成，整体示意图如图1(c)所示；FSR400面向组织固定于钉砧上，FSR400的阻抗值随其受到的压力增大而减小，调理电路将此阻抗的变化转换为电压信号，并经放大和滤波，送至DAQ数据采集卡转换为数字信号，传输至PC机，在Labview程序里进行读取、显示和存储。

1.2.3 便携式组织厚度测量仪

自制的便携式组织厚度测量仪如图1(a)、(d)所示。测量仪基于MASTERPROOF的0～25 mm千分尺170(Master Proof, 德国)和OMEGA的称重传感器LCKD-5(Omega, Connecticut, 美国)研制而成。LCKD-5通过自制结构连接于千分尺，见图1(d)，电子系统对传感器的输出信号进行调理、显示压强和蜂鸣提示，该测量仪能够在设定压强和保持时间条件下测量组织厚度。

图1 实验系统。(a)实验系统概览；(b)改造吻合器的夹持部分；(c)生物阻抗测量和微型压强检测系统；(d)千分尺及LCKD-5传感器Fig.1 Experimental system. (a) The experimental system overview；(b) The part of improved stapler for clamping tissue；(c) Schematic of bioimpedance measurement and micro-pressure measurement system；(d) Micrometer and LCKD-5

1.3 实验流程

预实验中，发现小肠组织阻抗频谱特性的beta散射在30 kHz以上；beta散射和细胞膜电容特性紧密相关，应用ColeY模型，可以对细胞内液和细胞外液进行区分识别[16-17，19]。因此，本研究阻抗测量选定30 kHz～5 MHz的54个数据点。

以不同的吻合器预定间隙对3个实验组的样本进行实验。将小肠样本水平铺在测量匣上，覆盖两个金电极；然后在组织和钉砧之间加入不同厚度h的垫片，缓慢闭合吻合器；当测量的压强值达到2 g/mm2时，保持10 s左右，进行第一次多频生物阻抗测量；然后闭合吻合器，每隔5 s测量1次多频生物阻抗，所有的实验组均在吻合器闭合后测量7次。在测量多频生物阻抗的同时，记录组织承受的压强。3个实验组的h分别是0(即无垫片)、0.26和0.52 mm。不同厚度的垫片用以产生不同的预定间隙，垫片采用特氟龙胶带制作。吻合器闭合条件下：无垫片时，钉砧和测量匣之间的间隙PG=0.8 mm；垫片为0.26 mm时，间隙PG=0.54 mm；垫片为0.52 mm时，间隙PG=0.28 mm。3组实验样本均进行8次多频生物阻抗测量，每组包括10个样本的测量数据。

1.4 ColeY模型与组织阻抗分析

1.4.1 生物组织的散射特性

多频生物组织阻抗具有散射特性，表现为电导从一个水平渐变为另一个水平、同时电纳出现峰值，或者电阻从一个水平渐变为另一个水平、同时电抗出现峰值。散射是由于组织内部不同成分的极化速度不同而引起的，随着电场频率由低到高，一些组织成分的极化速度无法跟上频率的变化，造成了散射。主要有alpha、beta和gamma散射，不同的散射机制不同。beta散射和细胞膜电容特性有关，使用合适的模型对beta散射对应频段内的多频生物阻抗数据进行拟合，能够反映细胞内、外液的变化[16]。本研究实验发现，在4 Hz ～5 MHz范围内，小肠组织的散射有2个，如图2所示。第1个散射的特征频率在60 Hz附近；第2个在2 MHz附近，beta散射的范围在100 kHz～100 MHz[16]。

图2 多频生物阻抗的散射Fig.2 Dispersion of mult-frequency bioimpedance

1.4.2 ColeY模型及Cole参数

ColeY模型可以用图3表达。G0与细胞膜外液电导相关；ΔG与细胞膜内液电导相关；ZcpeF与细胞膜阻抗，包含容性和阻性成分相关：CcpeF和RcpeF；cpeF属于一种符合Fricke定律的恒相位元件，是一种非理想、但却在生物组织中普遍存在的现象，比如细胞膜，通过使元件阻抗的相位恒定而使元件值具有频率依赖性。该模型和模型中的元件可用以下公式表达，有

(1)

(2)

(3)

(4)

式中，ω是角频率，τ是时间常数，ωτ没有量纲，α表达了频率依赖性[16]。

图3 ColeY模型Fig.3 ColeY model

应用非线性最小二乘法，使用式(1)～(4)对多频生物阻抗数据进行复数拟合，可得到拟合参数G0、ΔG、τ和α[21-22]。依次对测量样本在不同时间点的多频生物阻抗测量数据分别进行拟合，依据模型参数随时间的变化趋势，可以对组织内部的变化情况进行分析讨论。

由于IM3570自带误差补偿功能，能够消除寄生电容产生的影响，因此在多频生物阻抗数据分析过程中未考虑Hook效应[23]。

1.4.3 ColeY模型的生理意义

本研究采用ColeY模型对beta散射频段内的多频小肠组织阻抗数据进行拟合。G0是直流时组织的电导，由于细胞膜具有电容特性，对直流电流表现为开路，直流电流只从细胞外液流过，因此G0可以表征细胞外液电导，G0越大，细胞外液含量就越多；G∞是电流频率为∞时组织的电导，此时细胞膜的阻抗为零，细胞内液和外液之间呈并联状态，电流同时通过细胞内、外液，总电导G∞=ΔG+G0。ΔG=G∞-G0为细胞内液电导，ΔG越大，表征细胞内液含量越多。

1.5 数据分析

1.5.1 显著性分析

本研究采取配对样本t检验方式进行显著性分析，使用IBM公司的SPSS分析软件，将实验获得的模型参数数据按同预定间隙、相邻时间点进行配对，得到模型参数变化的显著性，P<0.05被认为具有显著性。此外，对压强数据和模型参数数据进行Pearson相关性分析，相关系数r>0.8认为极相关，P<0.05具有显著性。

1.5.2 组织学观察

本研究采用HE染色法，对样本进行石蜡切片、脱水和染色处理。切片中典型的结构包括绒毛、黏膜、黏膜下层腺、环形肌、纵行肌、浆膜。针对不同的预定间隙进行分组取样，同时加入一个空白的对照组，共计4组样本的切片进行分析。

2 结果

2.1 拟合结果

对测量数据进行ColeY模型拟合，结果如图4所示，其中顶点部分对应散射的特征频率，曲线与实轴有两个交点，较小的点为G0，较大的点为G∞。

图4 ColeY拟合圆图Fig.4 ColeY fitting circle diagram

2.2 参数变化趋势

G0随组织压榨时间的变化趋势如图5所示，整个变化可分为两个阶段。在阶段I，G0急剧减少；在阶段II，G0虽持续减少，但趋势比第一阶段弱。此外，随着预定间隙的减小，G0的减少趋势在增强。

图5 不同预定间隙下的G0的变化趋势Fig.5 The tendency of G0 under different PG

ΔG随组织压榨时间的变化的趋势如图6所示，也可以分为两个阶段。在阶段I，ΔG急剧减少，下降趋势随着预定间隙的减小而增加；在阶段II，ΔG没有明显的下降趋势，而是表现为轻微波动，波动幅度随着预定间隙的减小而减小，并开始出现轻微的下降趋势。

2.3 压强变化趋势

组织在吻合器压榨过程中受到的压强变化如图7所示，压强记录时间从吻合器闭合开始。压榨强度随着垫片厚度的增加而增加，提示随着预定间隙的减小，组织所受的压强显著增加。

图7 不同预定间隙下的压强测量结果Fig.7 The pressure measuring results under different PG

将每一样本受到的压强和对应的模型拟合参数进行Pearson相关性分析，结果如表1所示。可以发现，无论预定间隙是多少，对于所有的样本，G0和压强之间都具有显著的极相关性；而ΔG和压强之间具有显著极相关性的样本比例，随着预定间隙的减小而增加，当预定间隙为0.28 mm时，达到100%。

表1 压强和模型参数之间具有显著极相关性的样本数占总样本数的比例

Tab.1 The percentage of samples with highly significant correlation between pressure and model parameters in all samples

PG/mmP&G0/%P&ΔG/%0801004005410070028100100

注：压强P分别与G0和ΔG进行Pearson相关分析，相关系数r>0.8且P<0.05，被认为具有显著的极相关性。

Note: Pearson correlation analysis was performed between pressurePandG0,Pand ΔG, and significant correlation was accepted whenr>0.8 withP<0.05.

2.4 组织学观察结果

对不同预定间隙以及BLANK等4组样本进行染色处理，在50倍放大下，观察组织各部位的变化，如图8所示。组织在未经历压榨时，即BLANK对照组中，环形肌、纵行肌形态正常，黏膜层绒毛较清晰，组织总体形态较为圆润紧致；在0.8 mm预定间隙下时，相比未经历压榨的对照组变化不太大，纵行肌与环形肌的间隙略微变少，黏膜层中的空隙略微增加，绒毛仍可看到；当预定间隙减少至0.54 mm和0.28 mm时，环形肌和纵行肌开始出现断裂和稀疏现象，黏膜层明显变稀疏，绒毛形态不再清晰，并且这种程度随着预定间隙的减少而加重，可以看到0.28 mm预定间隙的样本与对照组已经差异很大，各结构不再完整，黏膜层与肌层都已被撕裂成许多离散的区域。

图8 组织学观察对比图。(a)对照组样本切片；(b)0.8 mm预定间隙组样本切片；(c)0.54 mm预定间隙组样本切片；(d)0.28 mm预定间隙组样本切片Fig.8 Histological observation of tissue specimens. (a)Specimen from blank group；(b)Specimenfrom group with 0.8 mm predetermined-gap；(c)Specimen from group with 0.54 mm predetermined-gap；(d)Specimen from group with 0.28 mm predetermined-gap

3 讨论

现有吻合器在使用过程中过度依赖于医生的判断和经验，容易造成对组织的作用不当，引发吻合口瘘[1-9]；电动吻合器的出现，使对组织的压榨模式、压榨强度和压榨时间等参数的优化更为迫切[10-11]。本研究探索了在吻合器作用下小肠组织阻抗的变化规律，为吻合器压榨参数优化工作打下了研究基础。

吻合器闭合时，小肠组织受到压榨作用。根据G0和ΔG的变化规律，吻合器的闭合过程分为两个阶段。在第1个阶段，吻合器被锁紧，钉砧和测量匣之间的距离迅速减小，小肠组织受到了剧烈的压榨，原本平铺在测量匣上的部分组织被挤压出钉砧和测量匣之间的空间，测量电极间的组织容量迅速减小，G0与ΔG同时迅速减小，提示此阶段组织容量减少，大量细胞被挤出，细胞内、外液同时快速排出。在第2个阶段，吻合器锁紧，持续对小肠组织压榨，使钉砧和测量匣之间的距离达到预定间隙。预定间隙较小，则组织受到的压榨强度较高；预定间隙较大，则压榨强度较低。在此阶段，G0持续减小，反映细胞外液持续减小，随着预定间隙的减小，即压榨强度的增加，G0减小的程度随之增加。与此同时，细胞内液随着压榨强度的变化却有所不同：当压榨强度较低时，ΔG表现为轻微波动，提示细胞内液没有明显的变化；当压榨强度增加时，ΔG的波动减弱，并开始出现轻微的下降趋势，提示随着压榨强度的增加，细胞内液逐渐排出。

表1列出了组织细胞内、外液电导变化和承受压强之间的相关性关系，表明小肠组织受到压榨时首先是细胞外液的排出，随着压榨的持续增加，细胞外液大量排出，细胞间歇减小，细胞内液承受压榨作用开始溢出，并随压榨持续增加而继续排出直至细胞破裂、损坏[24-25]。细胞内液在细胞受压的条件下排出，必然和细胞形变有着紧密关系。研究发现，细胞的受压形变是细胞死亡的诱因，更大的形变会引起更早的细胞损伤，持续的细胞形变是细胞死亡的主要原因[26]。因此，ΔG变化对应的组织状态变化也许可以用于吻合器对组织进行压榨情况的评价。

本研究的组织学观察结果表明，G0和ΔG表达的压榨作用过程与组织形态的变化基本吻合，解释了在显微观察图中看到的当预定间隙不断减少时组织内部结构不再饱满、开始变得稀疏的过程。同时，由于压榨强度的增加，在0.54 mm和0.28 mm预定间隙的这两组显微图中出现了肌层的断裂和绒毛破坏等现象，印证了过度压榨会对组织造成损伤。

4 结论

本研究初步揭示了吻合器作用下的小肠组织的内部变化情况，对细胞内液和外液的变化进行了区分。当压榨强度增加到一定程度时，细胞内液开始出现轻微排出现象，可能与细胞受压形变有关。由于细胞的受压形变与死亡之间存在着一定的关系，所以也许可以通过ΔG建立吻合器压榨参数的优化标准。未来的研究将对实验系统进行改进，细化实验参数；同时开展动物实验，结合电镜研究，对不同压榨参数下的组织损伤进行深入研究；最终目标是建立可靠的吻合器压榨参数的优化标准。

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Research on the Changes of Intra-and Extra-Cellular Fluid within SmallIntestine under Compression of Stapler

Zhou Yu*Zhang Kuan Xu Jingjing Ren Binbin Li Boting Song Chengli

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforxScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

To explicitly understand the internal changes of gastrointestinal tissue compressed by stapler is a great precondition for optimizing the stapler’s engineering parameters. However, relevant work has not been adequate. By a modified stapler with embedded detection electrodes, the multi-frequency bio-impedance of porcine small intestine under compression of the stapler was measured. The ColeYmodel was used to fit the measurement results and changes within the tissue were analyzed according parameters of the model.G0represents the extracellular fluid conductance and ΔGwas the intracellular fluid conductance. The changes ofG0and ΔGunder different compression strength were acquired by using spacers with different thickness. It turned out that the whole squeezing process was divided into two stages. At the first stage, two parameters were both falling fast. At the second stage, with the increase of compression strength,G0kept decreasing and the trend of ΔGwas changed from a slight fluctuation into a slight decline. When the thickness of spacer increased from 0 mm to 0.52 mm, the percentage of samples with highly significant correlation between pressure and ΔGin all samples was increased from 40% to 100%, however, the percentage forG0was constant as 100%. It was concluded that under the effect of stapler, a part of tissue of the small intestine was firstly squeezed out of the measurement space, which led to a rapid decline of parameters. After that, with stapler continuous pressing the tissue, extracellular fluid was kept discharged, and intracellular fluid showed different trends under different pressing strength, which might be related to the compression deformation of cells. This research provided a basis for optimizing the parameters of a stapler.

stapler; compression; ColeYmodel; multi-frequency bio-impedance

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 01.008

2016-03-15， 录用日期:2016-10-12

国家自然科学基金(51377024);上海市自然科学基金(14ZR1428300)

R318

A

0258-8021(2017) 01-0059-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: zhouyu_working@163.com