荧光免疫试条读数仪量程调节方法研究

高跃明 黄弘舟 林传阳 韦孟宇 杜 民 潘少恒

1(福州大学物理与信息工程学院，福州 350108)2(福州大学福建省医疗器械和医药技术重点实验室，福州 350002)3(澳门大学模拟与混合信号超大规模集成电路国家重点实验室，澳门 999078)

荧光免疫试条读数仪量程调节方法研究

高跃明1,2#*黄弘舟1,2林传阳1,2韦孟宇2,3杜 民1,2潘少恒3

1(福州大学物理与信息工程学院，福州 350108)2(福州大学福建省医疗器械和医药技术重点实验室，福州 350002)3(澳门大学模拟与混合信号超大规模集成电路国家重点实验室，澳门 999078)

随着荧光免疫层析技术朝着高灵敏度、宽检测范围的方向发展，对配套荧光免疫试条读数仪的检测要求也随之提高。通过研究荧光产生机理，建立调节量程的理论模型并提出一种提高荧光免疫试条读数仪检测上限和检测灵敏度的方法。设计数控恒流源调整光源的激发光强，实现对试条荧光信号的控制，从而调节荧光免疫试条读数仪检测量程。实验表明，该方法使荧光免疫试条读数仪具备更宽的试条浓度检测范围，有效提高其检测上限与检测灵敏度。实验以C-反应蛋白(CRP)作为待测物质，结果表明荧光免疫试条读数仪检测上限较调整前提高4倍，检测灵敏度提高1倍，在20～210μg/mL浓度范围内检测结果的线性拟合优度R2>0.99，与ESE的Quant分析仪在相同检测范围内的准确度一致性较好。

荧光免疫层析；量程调节；数控恒流源

引言

荧光免疫层析技术包含了免疫技术、层析技术以及定向标记技术[1-2]，具有灵敏度高、线性度好、检测范围宽等特点[3-5]，是当前床边即时检测(point of care testing, POCT)的发展趋势[6]。ESE公司生产的Quant分析仪(简称Quant)由于其内部芯片采样位数不足，导致Quant的试条最高可检测浓度(又称“检测上限”)偏低[7]。课题组前期研发的荧光免疫试条读数仪(简称“读数仪”)的试条检测灵敏度有限、检测范围固定，难以满足部分低浓度或高浓度试条的检测需求[8]。

随着荧光免疫层析技术的深入研究，高灵敏度、宽检测范围是该技术的发展趋势[3-5]，对配套读数仪的灵敏度、检测范围的要求也随之提高。但由于检测上限与检测灵敏度之间的矛盾[6]，普通读数仪很难满足试条各种浓度梯度的检测需求。

通常解决该问题的方法有提高模拟数字转换器(analog digital converter，ADC)的采样位数以及调节电路放大倍数，但是这两个方法仅能提高读数仪的检测上限，不能提高读数仪的检测灵敏度。本研究通过研究荧光产生机理[9]，建立调节量程的理论模型，设计出一种以调整光源光强来实现调节读数仪检测量程的方法来解决该问题。实验结果通过测试课题组前期研发的读数仪，得到使用该方法后系统的量程拓展范围、线性度以及与Quant比较准确度，用来验证该方法的有效性。

1 量程调节的理论模型与实现方法

1.1 理论模型

1.1.1 荧光免疫层析试条检测机理

荧光免疫试条经反应后，检测(Test，简称T)线与质控(Control，简称C)线富集了较多荧光标记物，能被紫光激发出高强度的荧光，而非T、C线区域的荧光标记物较少[10]。试条经读数仪检测后，系统获得荧光强度电压信号构成的光谱曲线[8]，光谱曲线上T与C线处各有一个较高的波峰，其峰值为该位置的荧光强度电信号(符号表示为Cx,x=1,2)，其余非T、C线的平缓区域为背景区域，其幅值为背景幅值。计算T线与C线位置上Cx的比值(简称T/C)获得检测结果，将检测结果与标准刻度曲线作比对，即可得到试条待测物浓度值[10]。

以If表示试条被激发的荧光强度，I0表示光源激发光强度，YF表示荧光效率，ε表示物质摩尔吸收系数，l表示激发光距离样品光程，c表示荧光物质浓度，构成关系[6]如下：

If=2.3YFI0εcl

(1)

在试条被检测过程中，T线与C线所处相同的检测环境，并且由同种荧光微球标记反应物[11]。结合式(1)可知，T线与C线的YF、ε、l是相同的，并且由相同光源照射T线与C线，所以有I0T=I0C，因此荧光免疫层析试条检测结果为

(2)

式中，CT与CC分别是T线位置与C线位置上的荧光物质浓度，从理论上可得出荧光免疫层析试条最终检测结果T/C只与T、C线上荧光标记物浓度有关，而与光源激发光强弱无关，因此改变光源激发光强度对检测结果T/C没有影响。

1.1.2 光源激发光强度调节机理

结合式(1)可见，测试同一样品的前提下，c不变，YF与ε只与荧光物质特性有关，当荧光物质特性不变时，它们是恒定的。因此当l不变时，荧光强度与激发光强度是成线性关系。

选用硅光电二极管S1133-14作为读数仪的光电转换器，其入射光强度与其产生的短路电流是成线性关系的[12]。光电转换器产生的电流经跨阻放大器转化为电压信号。因此，试条T线或C线位置上被激发的荧光信号经光电转换器转换为该位置上的Cx，由此结合式(1)将If线性替换为Cx，有

Cx=If=2.3YFεclI0

(3)

通过光纤光谱仪(型号：usb4000-vir-nir)探究LED光源(型号：T5H36)的电流与激发光强的关系，得到如图1所示的特性曲线。

图1 光源电流与光强关系Fig.1 The relationship between light source driving current and light intensity

LED光源最大工作电流为25 mA，因此提取电流值25 mA以下特性曲线，并运用最小二乘法参数估计，获得光源电流值与激发光强的关系，且拟合优度R2>0.99，由此可知LED光源电流值与光源激发光强度有着良好的线性特性，由此可得

(4)

式中，I0为光源激发光强度，ix为光源电流，α为两者的比例常数。

将式(4)代入式(3)中，有

Cx=2.3YFεclαix=βix

(5)

式中，Cx为T、C线其中一个位置上的荧光强度电信号，β=2.3YFεclα。

在用读数仪检测同一根试条的条件下，T线或C线位置上荧光物质浓度c分别保持不变，对于Cx与ix来说，β为常数，因此Cx与ix成线性关系。

1.2 实现方法

1.2.1 检测量程调节机理

读数仪量程调节流程如图2所示。

图2 检测量程调节流程Fig.2 The flow chart of detection range adjustment

读数仪检测低浓度试条时，试条被照射后激发出的微弱荧光信号经过采集、放大滤波等处理后，有用信号可能被噪声淹没，微处理器难以准确提取该Cx。系统通过调高ix，使激发光源光强增大，因此原先微弱的Cx也随之增强。同时，背景幅值也随ix增大，使得ADC采样量程的可用区间减少，因此系统控制数控电位器调低背景幅值，将其稳定在预设位置，使有用信号能充分利用ADC采样量程。最终系统实现检测量程低档位的调节，使得系统灵敏度提高，因此能正常提取低浓度试条的Cx。同理于读数仪检测高浓度试条，与检测低浓度试条进行反方向的调节。所以，系统能保证激发光源随待测试条初始Cx而调整其光强，使得各浓度的试条都能适应ADC采样量程，达到调节检测量程目的。

1.2.2 检测量程调节硬件设计

调节光强模块的核心是设计一个数控恒流源电路[14]，如图3所示，其功能是给读数仪中LED光源提供稳定可调的电流。微处理器通过调用数字模拟信号转换器(digitalanalogconverter，DAC)资源，输出可调的模拟电压信号并输入以运算放大器为核心的恒流源电路，以此实现数控恒流源输出稳定可调的电流给LED光源。

图3 数控恒流源示意Fig.3 The schematic diagram of digital controlled current source

荧光免疫层析试条反应过程中，由于荧光标记物在层析的过程中层析得不够充分，导致少量荧光标记物残留于试条背景区域上。因此，除了调节光强模块之外，还需要设计一个背景幅值调整模块，其功能是稳定试条背景区域幅值，提升ADC资源的利用率，使得背景区域幅值不会随光源光强而变化。背景幅值调整模块的硬件设计包含可调基准电路、减法电路与数字电位器[15]，其原理如图4所示。

图4 背景幅值调节示意Fig.4 The schematic diagram of background amplitude adjustment

1.2.3 检测量程调节控制方法

检测量程调节控制方法流程见图5，建立线性关系式，计算目标电流值与背景幅值方法如下。

图5 检测量程调节控制方法流程Fig.5 The flow chart of control method for detection range adjustment

由本文第2.1小节可得，电流与Cx成正比例关系，满足数学模型y=kx，试条上待测物的各种浓度梯度都有回归系数k与之对应。计算目标电流值，将预设电流值以及预提取的最大Cx作为横纵坐标代入关系式y=kx中，求得对应系数k，并在光源最大额定工作电流允许范围内以及ADC采样量程下计算出Cx最大值所对应的电流值，控制恒流源输出该电流值，调节Cx，进而间接调节读数仪的检测量程。调节背景幅值同理于调节Cx。

2 实验结果

采用课题组前期研发的读数仪[8]对使用调节量程方法前后的实验结果进行检测与分析，并与Quant(型号：ESLF50-MB-4031，生产公司：QIAGENGmbH,Hilden,Germany)作对比。

2.1 LED电流值与荧光强度电信号的关系

本文第1.1.2小节中，由式(5)从理论上推算出调节ix能线性控制试条T、C线的Cx。对同一浓度的试条进行ix与T线Cx关系的检测，如图6所示。

图6 荧光强度电信号与光源电流特性曲线Fig.6 The characteristic curve of the relative fluorescence intensity and the light source current

由图6可知，电流值在0～25mA内，T、C线的Cx与ix基本遵循线性响应特性，无法严格保持线性关系的原因为随着电流值的增加，激发光强度随之提高，使得荧光物质产生一定衰减。但运用最小二乘法参数估计，计算得出这组数据的拟合优度R2>0.97，说明模型拟合的优合度较高，荧光物质的衰减对线性响应特性的影响较小。因此，ix与Cx在LED光源额定工作电流下基本保持线性响应，所以可在该范围内进行读数仪量程调节方法的研究。

2.2 浓度检测范围

将10 mg/mL的CRP标准溶液按照比例进行稀释，得到一系列不同浓度的CRP样品溶液，分别手工滴加在空白试条上，待反应结束后进行检测，同时用Quant检测作为参照对比。

从表1中可见，使用量程调节方法前，读数仪检测的浓度值范围为1.95～256 μg/mL。对于下限1 μg/mL浓度试条，以及512 μg/mL以上浓度试条的测试结果分别为无结果和削峰。使用量程调节

表1 使用量程调节方法前后与Quant检测范围对比

Tab.1 Comparison of using range adjustment method before and after with the detection range of Quant

浓度/(μg/mL)量程调节前T/C量程调节后T/CQuantT/C204800———102400—2273—51200—1205—256．00637633—125．00285290—31250950930857810260250241950050050051．00—002003050———

注：—表示结果无效。

Note：“—”Indicates that the result is invalid.

方法后，浓度检测范围拓展为20～210μg/mL，可见该方法有效提高了系统的检测上限与检测灵敏度。

2.3 线性度测试

将表1中量程调节后读数仪检测所得结果采用最小二乘法进行线性拟合，所得直线为

y=0.022x+0.192

(6)

拟合优度R2>0.99。可见，在20～210μg/mL浓度范围内，量程调节后读数仪具有良好的线性度。同时，将表1中量程调节前后的检测范围与Quant的检测范围表示在图7中，体现读数仪线性度的同时，也体现出量程调节后读数仪检测范围的拓展效果。

图7 读数仪量程调节前后与Quant检测浓度线性对比Fig.7 The detection concentration linear contrast between the analyzer before and after range adjustment and Quant

2.4 准确度测试

将Quant检测结果线性拓展至本研究量程调节后读数仪的检测范围，在该范围内验证Quant与量程调节后读数仪检测结果的相关性。如图8所示，拟合优度R2>0.99，说明量程调节后读数仪检测结果具有良好的相关性，也证明其检测结果是准确的。

图8 量程调节后读数仪与Quant检测结果的相关性Fig.8 The correlation of detection results between the analyzer before and after range adjustment and Quant

3 讨论和结论

本研究提出一种荧光免疫层析读数仪量程调节的方法。该方法有效地拓宽荧光读数仪的试条浓度可检测范围，之前临床上难以检测的荧光试条浓度可以被有效提取出检测结果。该方法不仅能应用于荧光免疫层析读数仪，同样也能用于胶体金等基于光强度的免疫层析检测仪。

本研究从理论上证明出Cx与ix成线性特性，但是实际上由于存在荧光衰减，使得Cx与ix并没有严格遵循线性特性。因此，接下来将要研究荧光衰减对于Cx与ix关系曲线的实际影响，以获得更为精确的Cx与ix的特性关系。

本研究通过分析读数仪LED光源光强与试条检测结果T/C的关系、LED光源光强与电流的关系以及LED光源光强与试条激发出荧光强度的关系，建立了读数仪调节量程的理论模型，并且进行实际检测，验证该理论模型的真实性，得出可以通过控制读数仪中LED光源的光强调节读数仪的检测量程结论。该方法有效提高系统的检测上限与检测灵敏度，使读数仪具备更宽的试条浓度梯度检测范围，解决了读数仪难以满足试条各种浓度梯度检测要求的问题。

以CRP溶液稀释后配置的标准试条作为检测样本，荧光免疫试条读数仪检测上限较调整前提高4倍，检测灵敏度提高1倍，并且在20～210μg/mL浓度范围内具有良好的线性响应特性，拟合优度达到R2>0.99，与ESE Quant分析仪在相同检测范围内准确度有良好的一致性。

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Research of Range Adjustmentfor Fluorescent Immuno-Chromatographic Strip Analyzer

GaoYueming1,2#*Huang Hongzhou1,2Lin Chuanyang1,2Wei Mengyu2,3Du Min1,2Pun Siohang3

1(CollegeofPhysicsandTelecommunicationEngineering,FuzhouUniversity,Fuzhou350108,China)2(KeyLaboratoryofMedicalInstrumentationandPharmaceuticalTechnologyofFujianProvince,Fuzhou350002,China)3(DepartmentofElectricalandComputerEngineering,FacultyofScienceandTechnology,UniversityofMacau,Macao999078,China)

fluorescent immuno-chromatographic; range control; digital controlled current source

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 01.017

2016-05-21， 录用日期:2016-12-20

科技部港澳台科技合作项目(2012DFM30040)；福建省科技重大专项(2014YZ0001)

R318

D

0258-8021(2017) 01-0124-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: fzugym@163.com