HCV感染男性吸毒者血浆CCL19及CCL21浓度变化分析

李红霞 魏泉德 周 毅 李晓凤

(珠海市疾病预防控制中心，珠海519000)

HCV感染男性吸毒者血浆CCL19及CCL21浓度变化分析

李红霞 魏泉德 周 毅 李晓凤

(珠海市疾病预防控制中心，珠海519000)

目的：分析丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染男性吸毒者血浆CCL19及CCL21浓度变化。方法：采用定量ELISA法检测血浆CCL19和CCL21浓度，ELISA法检测血浆抗HCV，Real-time RT-PCR法检测HCV RNA，以国家哨点监测HCV感染的391名男性吸毒者为研究对象，60名健康男性为对照，分析不同抗HCV/HCV RNA状况男性吸毒者血浆CCL19和CCL21浓度变化。结果：391名男性吸毒者中，180名感染HCV，感染率为46.04%。未感染HCV男性吸毒组血浆CCL19及CCL21浓度较健康男性组升高(P≤0.001)。吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)组血浆CCL19和CCL21浓度最低，与其他组差异明显(P≤0.05)；吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)组的最高，与健康男性组差异显著(P<0.05)。结论：吸毒可使男性血浆CCL19和CCL21浓度升高。血浆CCL19和CCL21浓度升高可能有助于HCV自发清除；血浆CCL19和CCL21浓度降低可能预示着病程持续转归较差。

吸毒;抗HCV;HCV RNA;CCL19;CCL21

自1989年发现丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)以来，全球已有约3%的人感染了HCV。中国一般人群HCV感染率约3.2%；静脉吸毒者中，HCV的感染率达37.6%～90%[1,2]。HCV感染者约有18%～34%在急性期可自发清除病毒[3]，大多数则发展成为慢性感染，然后肝脏发生纤维化，约10%～20%患者发展成为肝硬化，这些肝硬化患者每年将约有1%～5%会发生肝细胞癌变，3%～6%发生肝功能失代偿[3]。病毒、宿主和环境因子的多样性影响着HCV感染的自然史，由于病毒基因组高度变异的特性，限制了疫苗的研制，也影响了有效清除HCV或控制感染治疗方案的确定。CCL19和CCL21是稳态(或淋巴样)趋化因子，通过与其共同受体CCR7结合在免疫应答中发挥着重要作用[4,5]，CCL19和CCL21血浆水平变化在HCV感染者病毒自发清除机制中是否有意义，目前尚未见这方面报道。本文将以健康男性为对照，对HCV感染男性吸毒者血浆CCL19和CCL21浓度变化进行分析，以期为防治HCV感染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 共有血浆样本451份，其中391份采自珠海市男性吸毒者，为国家监测吸毒人群抗HCV抗体项目；60份正常对照血浆样本采自健康男性体检者。

1.2 方法

1.2.1 抗HCV抗体和抗HIV抗体的检测 Anti-HCV ELISA检测试剂盒(批号：2015101312，有效期：20161016)和Anti-HIV ELISA检测试剂盒(批号：2015091512，有效期：20160918)均为丽珠集团有限公司生产。检测仪器为多功能酶标仪(型号：Spectra Max M2)。抗HCV抗体和抗HIV抗体的检测按试剂盒和仪器说明书操作。

1.2.2 CCL19和CCL21的检测 人CCL19和人CCL21定量ELISA检测试剂盒(批号均为20150901，有效期均为2016.03)为RB公司产品。检测仪器为多功能酶标仪(型号：Spectra Max M2)。CCL19和CCL21浓度的检测按试剂盒和仪器说明书操作。

1.2.3 HCV RNA的检测

1.2.3.1 HCV RNA抽提 采用QIAamp Viral RNA mini Kit(批号：151032813，有效期：2017.04.11)提取HCV RNA，HCV RNA抽提过程按试剂盒说明书操作。提取的RNA保存于-70℃备用。

1.2.3.2 Real-time RT-PCR 检测仪器为AB Applied Biosystems 7500 Real-time RT-PCR system。扩增试剂为AB Applied Biosystems Ambion Real-time RT-PCR Kit(批号：1504091，有效期：2016.4.10)。上游引物：5′-CGGGAGAGCCATAGTGGT-3′；下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCA-3′；探针：FAM-CAAGGCCTTTCGCGACCCAA-BHQ1。HCV RNA的检测按仪器和试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 统计学软件为IBM SPSS Statistics 22版，健康对照者和不同抗HCV/HCV RNA状况吸毒者血浆CCL19及CCL21水平比较采用方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况 451份样品均为成人男性(年龄19～59岁)血浆。 其中60份正常对照血浆抗HIV、抗HCV和HCV RNA检测均阴性；391份男性吸毒者血浆抗HIV均阴性，其中211份血浆抗HCV和HCV RNA均阴性，180份血浆抗HCV抗体和/或HCV RNA阳性， HCV感染率为46.04%。

2.2 吸毒对血浆CCL19和CCL21浓度的影响 从图1、2和表1、2可以发现，未感染HCV的男性吸毒组血浆CCL19和CCL21浓度均数均高于健康对照组，且差异具有显著统计学意义(P≤0.001)。

2.3 不同抗HCV/HCV RNA状况对血浆CCL19和CCL21浓度的影响 从图1、图2可以看出，未感染HCV[抗HCV(-)/HCV RNA(-)组]的男性吸毒组比健康男性组血浆浓度升高；感染HCV而体内未产生抗HCV抗体[抗HCV(-)/HCV RNA(+)组]的男性吸毒组血浆CCL19及CCL21浓度均下降，是各种抗HCV/HCV RNA状况组血浆浓度最低的；感染HCV并且体内已产生抗HCV抗体[抗HCV(+)/HCV RNA(+)组]的男性吸毒组，比抗HCV(-)/HCV RNA(+)组男性吸毒组血浆浓度高； 体内产生抗HCV抗体并已成功清除HCV[抗HCV(+)/HCV RNA(-)组]的男性组血浆浓度则更进一步升高。

图1 不同抗HCV/HCV RNA状况男性血浆CCL19变化(pg/ml)Fig.1 Level diversifies of plasma CCL19 in man with different anti-HCV/HCV RNA(pg/ml)Note: 1.Normal control；2.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(-)；3.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(+);4.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-)；5.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-).

图2 不同抗HCV/HCV RNA状况男性血浆CCL21变化(ng/ml)Fig.2 Level diversifies of plasma CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA(ng/ml)Note: 1.Normal control；2.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(-)；3.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(+);4.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-)；5.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-).

表1 不同抗HCV/HCV RNA状况男性血浆CCL19和CCL21水平差异

Tab.1 Differentiation of plasma CCL19 and CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA

SamplesCCL19(pg/ml)MinimumMaximumMeanStd.DeviationSig.CCL21(ng/ml)MinimumMaximumMeanStd.DeviationSig.CON602.340124.78047.96023.9500.0010.0101.7400.4400.3100.001A2115.930627.68094.680162.4400.0009.3401.3202.610B79.19043.52020.63012.8900.0000.3300.1000.120C1401.310621.97062.490120.6700.0009.7000.9102.060D3312.540602.360161.280202.0300.0009.1802.4303.310

Note：CON.Normal control；A.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(-)；B.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(+)；C.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(+)；D.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-).

表2 不同抗HCV/HCV RNA状况男性血浆CCL19与CCL21浓度比较(Sig.)

Tab.2 To compare level of plasma CCL19 and CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA(Sig.)

ItemsCON*ACON*BCON*CCON*DA*BA*CA*DB*CB*DC*DCCL190.0010.0050.8530.0290.0000.2940.5600.0040.0040.099CCL210.0000.0000.0920.0160.0000.6740.5300.0000.0030.148

Note：CON.Normal control；A.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(-)；B.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(+)；C.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(+)；D.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-).

通过对不同抗HCV/HCV RNA状况组血浆CCL19及CCL21浓度进行比较分析(表1)，发现对照组和不同抗HCV/HCV RNA状况男性吸毒组组间差异显著(P=0.001)。进一步多重比较(表2)发现，除吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)组外，其他组与健康对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(-)组与吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)组、吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)组的比较无明显差异；吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)组与其他各组差异明显(P≤0.005)。

3 讨论

趋化因子是一类小分子量的趋化性细胞因子，在白细胞游走和活化中发挥调节作用。大多数趋化因子有4个保守的半胱氨酸，根据前两个半胱氨酸的相对位置，将趋化因子分为C、CC、CXC和CX3C四个家族。CCL19和CCL21属于趋化因子CC家族，均位于人类9号染色体。CCL19蛋白包含 98 个氨基酸，主要在胸腺和二级淋巴器官内表达；CCL21编码110 个氨基酸，主要在淋巴结和脾脏 T 细胞富集区表达。CCR7是CCL19与CCL21的共同受体，其基因位于17号染色体。CCR7 在淋巴细胞向淋巴结归巢中发挥重要作用，CCR7缺失或者其配体CCL19和CCL21缺失，将会导致树突状细胞进入输出淋巴结受损和外周淋巴结结构异常[6]。

吸毒对身体的损害往往是全身性、连锁式的反应，对免疫系统的毒性作用主要表现为不同程度地削弱机体的免疫功能，包括非特异性和特异性功能。表1和图1、图2显示，男性吸毒者血浆CCL19和CCL21浓度高于男性非吸毒者的(P≤0.001)，这是否可能为吸毒在降低机体免疫功能的同时，为抵御外界化学、生物等各种有害因子的损伤，机体的免疫网络反馈调节机制发挥作用，通过某种上调机制升高血浆CCL19和CCL21浓度以促进抗原的呈递及增强淋巴细胞功能，这有待于进一步研究。

虽然大多数HCV感染者的自然病程是感染急性期→慢性肝炎→肝纤维化→肝硬化的过程，但仍有18%～34%的感染者在急性期可自发清除病毒[3]。一般而言，人群感染HCV的早期(也是感染急性期)会出现抗HCV(-)/HCV RNA(+)状况，但出现抗HCV(-)/HCV RNA(+)状况也可能是HCV感染慢性期因机体免疫反应低下未能产生抗HCV抗体。从图1、2可以发现，吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)组的血浆CCL19及CCL21浓度是几组中最低的，随着感染者体内特异性抗体的产生及病毒的清除，吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)组和吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)组血浆CCL19及CCL21浓度逐渐升高，对其进行统计学处理，表1 显示差异明显(P=0.001)。将不同抗HCV/HCV RNA状况男性吸毒组和正常对照组血浆CCL19和CCL21浓度进一步两两比较发现(表2)，除吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)组外，其他吸毒组与正常对照组差异显著(P≤0.005)，可能为感染者机体从抗HCV(-)/HCV RNA(+)到抗HCV(+)/HCV RNA(-)的抗病毒过程中调节CCL19和CCL21发挥作用时其浓度接近健康对照组所致。抗HCV(-)/HCV RNA(+)组血浆CCL19及CCL21浓度均值最低，而病毒自发清除组[抗HCV(+)/HCV RNA(-)]血浆浓度均值最高，这一“HCV感染-抗HCV抗体产生-HCV自发清除”伴随血浆CCL19及CCL21浓度逐渐升高的现象可能为机体感染HCV后免疫系统的反射性调节过程，也显示HCV自发清除可能与血浆CCL19及CCL21浓度升高有关。而血浆CCL19及CCL21浓度降低可能预示着病程持续转归较差。

尽管吸毒可使男性血浆CCL19和CCL21浓度升高，血浆CCL19及CCL21浓度升高可能有助于HCV自发清除，但不可否认，吸毒对机体免疫系统的损伤是整体性的，正如一般情况下病毒感染会导致外周血淋巴细胞升高不能说明病毒感染有益于机体，我们需辩证地看待吸毒使男性血浆CCL19和CCL21浓度升高这一现象。

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[收稿2016-09-22 修回2016-12-05]

(编辑 倪 鹏)

Level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in male drug users infected HCV

LIHong-Xia,WEIQuan-De,ZHOUYi,LIXiao-Feng.

ZhuhaiCentersforDiseaseControlandPrevention,Zhuhai519000，China

Objective:To analyze the level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in the male drug users infected HCV.Methods: The plasma CCL19 and CCL21,anti-HCV and HCV RNA were detected by ELISA quantitation,ELISA qualitation and Real-time RT-PCR respectively.Compared with 60 healthy man,the level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in 391 male drug users conducted as part of HCV Surveillance Programme in Zhuhai were analyzed.Results: 180 of 391 male drug users were infected HCV and the infection rate was 46.04%.The level of plasma CCL19 and CCL21 in the male drug users[anti-HCV(-)/HCV RNA(-)] were higher than that in the healthy man (P≤0.001).The level of plasma CCL19 and CCL21 in anti-HCV(-)/HCV RNA(+) group was lower than that in the others(P≤0.05) .Compared with that in the healthy man,the level of plasma CCL19 and CCL21 in the drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-) group had significant deviation(P<0.05).Conclusion: Drug abuse can heighten the level of plasma CCL19 and CCL21 in man.Increasing the level of plasma CCL19 and CCL21 may conduce to spontaneous HCV clearance.It may prognosticate that HCV infection will be persistent and have a bad consequence when the level of plasma CCL19 and CCL21 were degraded.

Drug abuse;anti-HCV;HCV RNA;CCL19;CCL21

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.022

李红霞(1969年-)，女，硕士，副主任技师，主要从事微生物分子流行病学方面研究。

R392.7

A

1000-484X(2017)05-0742-04