炎症因子、生长因子以及凋亡因子在压疮慢性难愈合性创面中的表达及作用*

王 莹， 代彦丽△， 朴金龙， 刘春节， 李萌萌， 姜丽萍

(1. 河南大学第一附属医院， 开封 475000； 2. 上海交通大学医学院附属新华医院护理部， 上海 200092)

炎症因子、生长因子以及凋亡因子在压疮慢性难愈合性创面中的表达及作用*

王 莹1， 代彦丽1△， 朴金龙1， 刘春节1， 李萌萌1， 姜丽萍2

(1. 河南大学第一附属医院， 开封 475000； 2. 上海交通大学医学院附属新华医院护理部， 上海 200092)

目的：探讨炎症反应、生长因子及凋亡因子在压疮慢性创面中的表达及作用。方法：选取2013年10月至2015年7月河南大学第一附属医院收治的患者，其中临床Ⅲ、Ⅳ期压疮患者共20例，急性创面10例，正常皮肤组织6例。通过HE染色观察不同创面组织的形态学特征；免疫组织化学法检测组织中细胞凋亡因子Caspase-3的分布规律；荧光定量PCR法定量分析IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、bFGF及其受体KDR、FGFR1基因水平的变化特征。结果：Ⅲ、Ⅳ期压疮创面中可见炎性细胞浸润；凋亡信号因子caspase-3在压疮组中的表达高于其他两组，差异有统计学意义;IL-1β、IL-6、TNF-α表达高于急性创面组和正常皮肤组；VEGF和bFGF生长因子及其受体KDR和bFGFR1表达分别低于对照组。结论：炎症因子和凋亡因子在压疮慢性创面中持续长时间的高表达、生长因子及其受体显著的低表达可能是压疮慢性难愈合性创面形成的机制和难以彻底治愈的重要因素。

炎症因子；凋亡因子；生长因子；压疮；慢性创面

【DOI】 10.12047/j.cjap.5425.2017.046

压疮(pressure ulcers，PU)又称为压力性溃疡或褥疮，好发于年老体弱、脊髓损伤等长期卧床或坐轮椅的患者，压疮一旦发生可累及皮下组织，肌肉及骨骼而经久不愈形成慢性难愈合性创面[1]，简称慢性创面。慢性创面的治疗和修复一直是困扰国内外学者的重点和难点问题。细胞因子和生长因子在创面愈合中起着重要的作用,它调控细胞的增殖、分化、迁移与代谢。细胞凋亡因子Caspase-3是凋亡信号转导通路中最重要的蛋白酶和凋亡执行者，细胞凋亡过度和增殖不足可导致慢性创面愈合延迟。压疮慢性创面是否也存在这些问题尚不清楚，该文章以此为切入点探讨压疮的难愈合机制，针对内因，为临床采取有的放矢的干预措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 各组创面的纳入和排除标准

1.1.1 压疮创面 (1)纳入标准：根据美国压疮顾问小组(National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP)在2007年2月制定的压疮诊断标准[2]，临床收集已确诊的Ⅲ、Ⅳ期压疮慢性难愈合创面。Ⅲ期压疮为全层皮肤组织缺失，可见皮下脂肪暴露，但骨头、肌腱、肌肉未外露，可能伴有潜行或窦道；Ⅳ期压疮为全层组织缺失，皮下肌肉、骨骼肌组织外露，伤口床的某些部位有腐肉或焦痂，坏死组织呈黑色，可伴有潜行或窦道。(2)排除标准：糖尿病患者，心、肝、肾功能衰竭患者；糖尿病溃疡、静脉溃疡、癌症溃疡、放射性溃疡、严重感染、溃疡处有明显化脓性感染的组织；皮肤病患者；创面使用过各种生长因子或急性外伤创面。

1.1.2 急性创面 (1)纳入标准：根据伤口愈合理论及结合动物实验研究结果为理论依据[3]，选择急性外伤后第3～7天并于2周内愈合的创面。(2)排除标准：各种病因所致的慢性创面、皮肤病、创面有明显感染、患有严重器质性疾病的患者。

1.2 临床资料及分组

2013年10月至2015年7月笔者单位收治的患者，其中临床Ⅲ、Ⅳ期压疮患者共20例，男8例、女12例，年龄(53±9)岁；急性创面10例，男6例、女4例，年龄(50±7)岁；正常皮肤组织6例，男3例、女3例，年龄(54±3)岁。按照临床手术中采集样本的部位，本研究对象共分为四组：压疮中心组20例、压疮边缘组20例、急性创面组10例、正常皮肤组6例。四组患者间年龄比较无统计学差异。鉴于伦理学原则，正常皮肤组织来源于手术中切取弃用组织。

1.3 取材及检测指标

1.3.1 样本的获取 所有创面组织均为手术过程中无菌状态下切除的组织，标本取大小为0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，用4%多聚甲醛溶液固定，脱水，常规石蜡包埋切片后备用。

1.3.2 HE染色 常规苏木素-伊红染色，NIKON显微镜观察，NIS Elements图像采集软件采集图像，光学显微镜下观察不同样本组织形态学改变。

1.3.3 Caspase-3蛋白表达 应用DAB辣根过氧化物酶显色法检测组织中Caspase-3的表达(兔多克隆抗体Caspase-3购自美国SANAT CRUZ公司)，实验操作严格按照免疫组化SABC试剂盒说明书步骤进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。在400倍光学显微镜下，每组任意挑选5张切片，每张切片选择5个以上不重叠视野，观察阳性细胞分布和着色情况，采用Image-Pro-Plus 6.0计算机图像分析软件以积分光密度值(IOD)检测Caspase-3阳性细胞表达的强弱，IOD值越高说明蛋白表达含量越高。

1.3.4 IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、KDR、bFGF和FGFR1 mRNA的表达 采用实时荧光定量RT-PCR(Real time RT-PCR)检测不同组别中基因的表达。从GenBank获得目的基因mRNA的全长序列，利用引物设计软件Primer Express(美国ABI公司产品)设计引物序列，经Blast分析，引物序列具有特异性，所用的引物及内参GAPDH均由上海捷瑞生物工程有限公司引物合成。联合运用2-△△Ct法分析real-time PCR数据、Light Cycler Data Analysis软件和MS Excel分析初始数据(表1)。

Tab. 1 Gene primer sequences for human IL-1β, IL-6, TNF-a, VEGF, VEGFR, bFGF, FGFR1and GAPDH

GenePrimersequence(5'to3')AmplifiedfragmentlengthIL-1β(h)-FAGTGGCAATGAGGATGACT-TGT129IL-1β(h)-RGCTGTAGTGGTGGTCG-GAGATIL-6(h)-FAACCTGAACCTTC-CAAAGATGG163IL-6(h)-RTCTGGCTTGTTCCTCAC-TACTTNFα(h)-FTCTTCTGCCTGCTGCACTTT-GG133TNFα(h)-RTGGGCTACAGGCTTGT-CACTCGbFGF(h)-FGAGAAGAGCGACCCTCA-CATCA101bFGF(h)-RTCCTTCATAGCCAGGTA-ACGGTFGFR1(h)-FAGTACGGCAGCATCAACCA-CAC122FGFR1(h)-RGAACTCCACGTTGCTAC-CCAGGVEGF(h)-FCGCAGCTACTGCCATCCAAT192VEGF(h)-RGTGAGGTTTGATCCGCATA-ATCTVEGFR(h)-FGCCTACCTCACCTGTTTCCT-GTA114VEGFR(h)-RCGGCTCTTTCGCTTACTGT-TCTGGAPDH(h)-FAGGGGTCTACATGGCAACTG228GAPDH(h)-RCGACCACTTTGTCAAGCTCA

IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-a: Tumor necrosis factor a; bFGF: Fibroblast growth factors 2; FGFR1: Fibroblast growth factors receptor 1; VEGF: Vascular endothelial growth factor; VEGFR: Vascular endothelial growth factor receptor; GAPDH: Glyceraldehydes phosphate dehydrogenase; Tm=60℃ for all genes

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 组织形态学观察

光镜下对比可见：正常皮肤组织分布整齐规律，见少量的成纤维细胞，急性创面组织中可见有大量的成纤维细胞和血管内皮细胞、部分炎性细胞；压疮边缘组织中可见炎性细胞聚集增多、新生毛细血管增加、成纤维细胞、内皮细胞增多，压疮中心组织表达同边缘部位但表达量相应减少并出现有坏死组织(图1)。

Fig. 1 Representative histopathology images(HE×200) A: Normal skin; B: Acute wound; C: PU margin; D: PU center Stained with HE form; Arrows: Inflammatory cells, fibroblasts and vascular endothelial cells

2.2 各组创面中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-a基因表达

联合运用2-△△Ct法、Light Cycler Data Analysis软件和MS Excel分析法进行相对定量分析，结果显示IL-1β、IL-6、TNF-a mRNA在压疮边缘组表达高于压疮中心组(P<0.01)，压疮边缘组与压疮中心组中的IL-1β、IL-6、TNF-a mRNA表达均明显高于急性创面组(P<0.01)；三组与正常皮肤组织相比，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。

GroupnIL-1βIL-6TNF-aNormalskin6111PUcenter208.47±0.88**##△△8.26±0.21**##△△6.32±2.39**##△△PUmargin2021.58±1.81**##19.76±3.21**##15.88±5.17**##Acutewound103.49±0.29**4.13±0.56**2.81±1.35**

**P<0.01vsnormal skin；?##P<0.01vsacute wound；

△△P<0.01vsPU margin

2.3 各组创面中VEGF及其受体KDR基因表达

经荧光定量PCR技术检测分析，结果显示VEGF及其受体KDR mRNA在压疮中心组表达低于压疮边缘组 (P<0.01)；在压疮中心组中和压疮边缘组的表达均明显低于急性创面组(P<0.01)；三组与正常皮肤组织相比，差异有统计学意义(P<0.01,表3)。

GroupnVEGFKDRNormalskin611PUcenter202.95±0.31**##△△0.16±0.02**##△△PUmargin208.22±0.89**##0.46±0.05**##Acutewound1018.57±1.22**1.96±0.14**

VEGF: Vascular endothelial growth factor; KDR: Vascular endothelial growth factor receptor 2

**P<0.01vsnormal skin；?##P<0.01vsacute wound；

△△P<0.01vsPU margin

2.4 各组创面中bFGF及其受体FGFR1基因表达

GroupnbFGFFGFR1Normalskin611PUcenter202.50±0.35**##△△0.24±0.06**##△△PUmargin205.86±0.48**##0.41±0.02**##Acutewound1010.81±1.75**1.67±0.08**

bFGF: Fibroblast growth factors; FGFR1: Fibroblast growth factors receptor 1

**P<0.01vsnormal skin；?##P<0.01vsacute wound；

?△△P<0.01vsPU margin

2.5 细胞凋亡因子Caspase-3蛋白在不同创面组织中的表达

正常皮肤组织中Caspase-3表达较少为 107.50±5.77，阳性颗粒主要见于表皮基底层细胞和内皮细胞中；急性创面中阳性表达为182.93±14.17，阳性信号主要分布于成纤维细胞和血管内皮细胞中；压疮中心组织和压疮边缘组织中的阳性细胞表达分别为329.10±7.89、251.19±13.67，位于成纤维细胞、血管内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞(图2)

用IPP 6.0计算机图像分析技术对Caspase-3的表达进行灰度半定量(IOD)分析，结果显示各组创面中Caspase-3表达量总体相比差异具有统计学意义(F=49.97，P<0.01)；Caspase-3在压疮中心组表达高于压疮边缘组，差异具有统计学意义(P<0.01)，压疮边缘组和压疮中心组的表达量显著高于急性创面组，差异显著(P<0.01)，三组分别与正常皮肤组对比差异具有统计学意义(P<0.01,图3)。

Fig. 2 Immunohistochemical staining for caspase-3 expression (short arrows) in normal skin (A), acute wounds (B), PU margins (C) and PU centers(D)(IHC×200)

Fig. 3 Immunohistochemical analysis of image gray integral optical density (IOD) of caspase-3 protein in different groups**P<0.01vsnormal skin；?##P<0.01vsacute wound；△△P<0.01vsPU margin

3 讨论

本文从形态学角度可观察到压疮晚期创面组织中见大量的中性粒细胞和部分成纤维细胞、内皮细胞等，与之前Robert[4]报道的研究结果吻合。同时采用荧光定量PCR方法发现压疮中心和边缘组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平较急性创面增高，同时压疮边缘组织中的炎症因子的表达高于压疮中心组织，创面边缘炎性反应较强，与HE染色组织形态学结果一致。大量的炎症因子持续长时间的高表达可导致影响创面愈合的一些破坏性酶的产生，降解细胞基质和纤连蛋白，进而导致创面的难愈合。课题组前期动物实验已证实压疮中的炎症细胞聚集、细胞肿胀、代谢紊乱等原因而导致组织的损伤[5]，本文从任何动物压疮模型都无法复制的人体标本这一角度出发，更精确地研究晚期压疮的难愈合机制，得出两者结论相似。说明炎症反应的长时间高表达可能是导致压疮难愈合的一个重要因素。已有研究发现应用IL-1受体的拮抗剂可以减弱TNF-α引起的伤口组织的抗断裂强度，而应用TNF-α的抑制剂可以减弱糖尿病引起的成纤维细胞的凋亡和caspase-3的活性，从而改善糖尿病的治愈[6]。晚期压疮慢性难愈合创面的治疗是否可以考虑应用炎症因子受体阻断剂来干预，有待于进一步深入研究。

VEGF是血管生长的最重要的生长因子，填补压疮中缺失组织起着关键作用。而bFGF可加速创面肉芽组织的生成和上皮细胞的形成，促进创面的愈合。实验结果显示压疮中心组织中的VEGF、bFGF及其受体KDR、bFGFR1的表达明显低于压疮边缘组织，但两者都显著低于急性创面，差异有统计学意义，说明从压疮中心到压疮边缘组织修复能力增强，但与急性创面相比，压疮创面分泌的生长因子仍不能满足正常创面愈合所需，这可能与修复细胞的构型或活性改变导致功能受损或受体表达减少不能与生长因子结合发挥其生物学功能有关，从而导致创面愈合障碍。我们的研究结果和糖尿病溃疡中生长因子及其受体的减少或结合障碍是导致创面难愈的重要因素这一结论基本吻合[7]。由于生长因子需和其特定的受体结合才能发挥其生物学的功能，受体的表达减少导致生长因子无法与其受体结合，这也可能是导致其难愈合的又一重要原因。

Caspase-3是Caspase家族中介导凋亡的关键效应酶，是执行凋亡的重要效应分子。Caspase-3的活化标志着凋亡进入不可逆的阶段。因此在凋亡的研究中备受关注。有学者指出持续的缺氧刺激下激活TNF-α,同时伴随着IL-1β促进细胞凋亡,这提示凋亡可能是创面愈合延迟的重要因素[8]。本研究结果表明压疮中心组织凋亡信号最强，表达最高，导致组织受损最严重，这和HE染色光学显微镜下观察到压疮中心组织出现部分组织的坏死结论一致，但与部分学者提出的创伤早期细胞凋亡仅限于创面边缘，随后出现在损伤中心上皮的这一观点稍有矛盾，我们认为在压疮晚期难愈合创面中，损伤由中心向周围扩散，导致组织坏死和全层皮肤的缺失，而在愈合过程中，伤口是由边缘向中心肉芽组织的填充，上皮的爬行过程，与压疮边缘的凋亡较压疮中心弱这一结果相符合。实验中还发现压疮组织中凋亡的表达均高于急性创面组织，说明压疮创面中呈现凋亡过度的现象，潘莹莹[9]等指出压疮组织的损伤是由于内质网应激反应诱导细胞凋亡，而应用其抑制剂4-PBA可降低内质网应激水平，从而可减轻细胞凋亡保护受损组织，从反方向验证凋亡导致压疮的发生，这与我们的研究结果相似。适度的凋亡有利于清除真皮层中有害的炎性细胞的聚集、渗透、大量的活性氧和炎症因子等，减轻炎症反应促进创面愈合，而过度的凋亡则延缓创面修复，导致伤口难以愈合，这可能是阻碍或延迟压疮创面难愈合的重要机制。

综上所述，本研究结果显示压疮慢性创面的难愈合可能与炎症长时间高表达、生长因子及其受体的低表达以及细胞过度凋亡等多种因素相关，本研究从一个综合的角度分析压疮难愈合的分子机制，为今后临床晚期压疮的治疗提供理论依据和寻找新的干预靶点提供思路。

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The expressions and functions of inflammatory cytokines, growth factors and apoptosis factors in the late stage of pressure ulcer chronic wounds

Wang Ying1, Dai Yai-li1△, Piao Jin-long1, Liu Chun-jie1, Li Meng-meng1, Jiang Li-ping2

(1. The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475000； 2. Department of Nursing,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective: To study the distribution and expressions of inflammatory, growth factors, apoptosis factors in the late stage of pressure ulcer chronic wounds. Methods: Twenty patients were recruited from the First Affiliated Hospital of Henan University during Octomber 2013 to July 2015. Including twenty patients of stage III,Ⅳ pressure ulcer, ten acute injury patients and six normal health persons. The histological changes of different wounds were observed by HE staining, the distribution of Caspase-3 protein in four groups was detected by immunohistochemistry technique. The expressions of mRNAs for interleukin (IL)-1β, interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor-a (TNF-a),vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2(KDR), fibroblast growth factors(bFGF) and fibroblast growth factors receptor1 (FGFR1)were determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Results: Large numbers of inflammatory cells were found in the stage of Ⅲ, Ⅳpressure ulcer wound under HE staining. The levels of Caspase-3 were mainly localized in fibroblasts or endothelial cells. Compared with the other two groups, the expression of Caspase-3 in pressure ulcers groups was higher (P<0.01). The expressions of IL-1β, IL-6 and TNF-α were higher than those of the acute group and normal group. The expressions of VEGF, KDR, bFGF and FGFR1 were lower than those of the control group respectively. Conclusion: Overproduction or prolonged expression of inflammatory factor and apoptosis factor, the expression of VEGF and its receptor KDR and bFGF and its receptor FGFR1 were significantly decreased in the stage Ⅲ, Ⅳ pressure ulcer wound. These characteristics can be used to comprehensively evaluate etiology and treatment of pressure ulcer chronic wounds.

inflammatory; growth factors; apoptosisfactors; pressure ulcers; chronic wounds

河南省科技发展规划(142300410129)；河南省教育厅河南省高等学校重点科研项目基金资助(16B320001)

2016-02-17

2016-12-14

R47

A

1000-6834(2017)02-181-05

△【通讯作者】Tel： 18800081558； E-mail： iamdxm@163.com