血必净对大鼠急性肺损伤的保护作用*

罗 鹏, 周振兴

(1. 天津市东丽医院急诊科, 天津 300300； 2. 首都医科大学附属北京中医医院检验科, 北京 100010)

血必净对大鼠急性肺损伤的保护作用*

罗 鹏1, 周振兴2△

(1. 天津市东丽医院急诊科, 天津 300300； 2. 首都医科大学附属北京中医医院检验科, 北京 100010)

目的：研究血必净对急性肺损伤大鼠的保护作用。方法：60 只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松(10 mg/kg)组与血必净低、中、高剂量(5、10、15 ml/kg)组，每组10只。通过腹腔注射5 mg/kg内毒素建立大鼠急性肺损伤模型，模型成功4 h 后腹腔注射给药，每天1 次，连续7 d；正常对照组和ALI模型组静脉注射等体积的生理盐水。7 d后采集动脉血，检测动脉血氧分压(PaO2)、血清丙二醛(MDA)浓度和超氧化物歧化酶(SOD)的活性；取肺组织，检测肺系数(LI)、左肺湿/干质量比(W/D)、肺含水率[(W-D)/W]，检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)和高迁移率族蛋白-1 (HMGB1)蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠LI、W/D、(W-D)/W, TNF-α和HMGB1蛋白表达以及血清MDA含量升高，PaO2， IL-10蛋白表达和血清SOD活性减弱，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，血必净低、中、高剂量组大鼠LI、W/D及(W-D)/W，TNF-α和HMGB1蛋白表达以及血清MDA含量降低，PaO2，IL-10 蛋白表达和血清SOD活性增强，差异有统计学意义(P<0.01)，其中血必净高剂量组效果较好，与中、低剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.05)。结论：血必净能减轻对内毒素诱导的急性肺损伤，其药理机制可能与下调TNF-α 和HMGB1蛋白表达和血清MDA水平和上调IL-10蛋白表达和血清SOD活性有关，且以高剂量组效果较好。

血必净；内毒素；急性肺损伤；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10；高迁移率族蛋白-1

【DOI】 10.12047/j.cjap.5464.2017.034

急性肺损伤(the acute lung injury, ALI)是指各种直接或间接致伤因素引起肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛损伤，释放多种炎症介质及氧自由基[1]，其中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-10)在急性肺损伤的发生发展中起关键作用[2-3]。ALI是多器官功能障碍综合征(MODS)的起始阶段, 启动全身其他脏器损伤, 其发病机制复杂、病死率高，早期防治ALI对预防MODS的发生发展具有重要意义[4]。经过大量的临床实践证明，血必净用于治疗急性肺损伤患者效果满意, 为进一步探讨其作用机理, 本实验采用大鼠腹腔注射LPS诱导急性肺损伤模型，并采用血必净干预，观察干预后肺组织中各种因子的变化，评价血必净对大鼠急性肺损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

I-STAT200血气分析仪(美国雅培公司生产)；Microm HM315 型切片机(美国Thermo公司生产)；YB-6LF型包埋机(湖北亚光医用电子技术有限公司生产)； Flexstation 3 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司生产)。

1.2 试剂

血必净注射液(10 ml/支，天津红日药业有限公司生产)；内毒素(LPS，美国Sigma 公司生产)；TNF-α、IL-10、 HMGB1羊抗多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；TNF-α、IL-10免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；MDA、SOD检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司)。

1.3 动物

SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，体质量(180±20)g，购自天津中医药大学动物实验中心。

1.4 模型制备及分组

采用腹腔注射5 mg/kg LPS制备急性肺损伤大鼠模型。健康Wistar大鼠60 只随机均分为6组，即正常对照组、ALI模型组、地塞米松(10 mg/kg)组与血必净低、中、高剂量(5、10、15 ml/kg)组，每组10只。复制模型4 h后腹腔注射给药，每天1 次，连续7 d。正常对照组和ALI模型组静脉注射等体积的生理盐水。

1.5 动脉氧分压检测

取主动脉血0.5 ml，用肝素抗凝，迅速进行血气分析，检测动脉氧分压(PaO2)。

1.6 血清MDA、SOD检测

实验最后一天给药1 h后通过大鼠腹主动脉采血，3 000 r/min离心15 min分离血清，分别采用硫代巴比妥酸法和亚硝酸盐法检测血清中MDA含量和SOD活力。根据说明书要求，按顺序加入待测标本和试剂，最后分别在532 nm和550 nm处用分光光度计测定OD值，用提供的公式分别计算MDA浓度和SOD活力。

1.7 肺系数(LI)、肺湿/干质量比(W/D)与肺含水率(W-D)/W

大鼠采血结束后，用剪刀剪开胸腔，取出全部肺组织并用滤纸吸除肺表面的液体，称取肺组织质量，计算肺系数[肺质量(mg)/体质量(g)×10]。取大鼠左肺，称湿质量后，置烤箱中，60℃连续烘烤48 h，取出称其干质量，计算W/D[肺湿质量(mg)/肺干质量(mg)×100%]、肺含水率[(W-D)/W×100%]。

1.8 肺组织TNF-α、IL-10、HMGB1蛋白表达

留取右肺下叶组织用10%甲醛固定，常规脱蜡、水化、柠檬酸浸泡，标本染色按说明书步骤进行操作。所有切片放大倍数为40倍，每张切片随机选取直径为1 mm 的10 个视野进行观察，利用图像分析软件(LEICAQwin)测定阳性反应物相对含量的平均灰度值，以单位面积平均灰度作为参数进行统计。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 血必净对大鼠LI、W/D、肺含水率以及动脉氧分压的影响

与正常组相比，ALI模型组大鼠LI、W/D、肺含水率明显增加，动脉氧分压明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与ALI组比较，血必净剂量组大鼠LI、W/D、肺含水率明显降低，动脉氧分压明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与血必净低剂量组比较，血必净中、高剂量组大鼠LI、W/D、肺含水率明显降低，动脉氧分压明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 血必净对大鼠TNF-α、IL-10、HMGB1蛋白表达的影响

与正常对照组比较，ALI组大鼠肺组织TNF-α、HMGB1蛋白表达增强，差异有统计学意义(P<0.01)；与ALI组相比，血必净剂量组大鼠肺组织炎性因子TNF-α蛋白表达明显减弱，有统计学差异(P<0.01)；与血必净低剂量组相比，血必净中、高剂量组大鼠肺组织炎性因子TNF-α蛋白表达明显减弱，有统计学差异(P<0.01，表2)。

Tab.

LI: Lung index; W/D: Wet/dry weight ratio; (W-D)/W： Moisture content of lung; PaO2: The arterial oxygen tension

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsdexamethasone group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

GroupTNF-αIL-10HMGB1 Normal69.82±4.96113.70±4.7680.30±5.85Model116.05±3.78**75.40±2.01**122.40±4.55**Dexamethasone91.81±5.12##101.47±3.11##94.60±5.52##Low94.60±4.72##86.70±3.68##△△111.60±4.25##△△Middle80.28±6.90##△△▲▲90.70±2.71##△△92.60±4.45##▲▲High72.50±5.10##△△▲▲101.90±5.07##▲▲○○85.70±3.74##△△▲▲○○

TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-10: Interleukin-10; HMGB1: High mobility group protein B1

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsdexamethasone group;?▲P<0.05，▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

2.3 血必净对大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响

与正常对照组比较，ALI组大鼠血清SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与ALI组比较，血必净剂量组大鼠血清SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；血必净低剂量组，血必净中、高剂量组大鼠血清SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01，表3)。

GroupSOD(U/L)MDA(nmol/ml)Normal101.06±3.562.65±0.18Model68.19±3.29**4.44±0.21**Dexametha-sone78.73±3.97##2.70±0.13##Low76.08±3.57##3.01±0.21##△△Middle83.91±1.70##△△▲▲2.86±0.17##△High90.37±4.76##△△▲▲◇◇2.63±0.10##▲▲○○

SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsDexamethasone group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

3 讨论

革兰阴性菌细胞壁主要成分是LPS，其所致败血症是导致ALI 的常见原因。大鼠通过腹腔注射、静脉注射、气管滴注输入的方式给予LPS能够造成大鼠ALI模型[5-6]。本研究中，大鼠腹腔注射内毒素以后，肺组织LI、W/D 及肺含水率等指标明显升高，提示明显肺水肿的病理改变；动脉血氧分压降低，说明肺功能受损，急性肺损伤模型复制成功。

ALI主要表现为肺微血管通透性增高，导致肺水肿的产生和透明膜的形成,同时伴有肺间质纤维化的产生[7]。本结果显示, 大鼠腹腔注射内毒素后,肺含水量增加和动脉血氧分压降低。

近年来研究表明，HMGB1是一种核内蛋白，是内毒素致大鼠急性肺损伤的晚期重要的炎症介质。HMGBl致病作用的另一大特点是对炎症具有维持和放大作用。细胞受到感染因素或非感染因素的刺激，可主动或被动释放HMGB1。HMGB1通过与晚期糖基化终末产物受体及TLR4，2 结合， 将信号传到细胞外环境。同时，研究发现，HMGB1可被分泌到胞浆乃至胞外，可与TNF-α等重要炎症因子相互诱生，引起炎症信号分子NF-κB 的核移位。抗HMGB1抗体对内毒素诱导的急性肺损伤、脓毒症均有积极的治疗作用。

本研究发现, 内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织炎症因子TNF-α、HMGB1 蛋白表达明显增加，而IL-10明显降低；血必净治疗能明显降低TNF-α, HMGB1的蛋白表达,升高IL-10的蛋白表达，调节体内炎症因子的生成,减轻肺脏的炎症反应。说明血必净可以通过降低TNF-α、HMGB1等炎性反应因子的蛋白表达水平、增强抗炎因子IL-10 的蛋白表达水平，重建体内炎症介质/抗炎介质的平衡，抑制急性肺损伤的发展。

肺受到损伤时，肺组织内氧自由基大量增加，机体同时启动自身的抗氧化系统，抵御氧自由基的过量损伤，若机体抗氧化系统机能低下，急性肺损伤则迅速发展，这一事实已为人们所公认[8]。正常机体，氧化-抗氧化酶系统保持相对的平衡。各种损伤因素可以导致氧自由基的过多释放，引发脂质过氧化反应产生大量的MDA， 检测大鼠血清中MDA 可以反映机体氧自由基产生的速度和强度[9]。SOD是机体清除氧自由基最重要的酶之一[10-11]，检测大鼠血清中SOD水平可以反映机体内清除氧自由基的能力。结果显示，模型组血清SOD 活性与正常组相比明显降低，血必净剂量组与模型组相比，大鼠血清SOD活力明显升高，说明血必净有抵抗氧自由基损伤的作用。文献报道血必净注射液对应激性脏器损伤具有良好的保护作用，同时可通过保护血管内皮细胞，改善器官超微结构的损伤[12-13]。本研究中，急性肺损伤大鼠给予血必净注射液治疗后，可显著降低大鼠的MDA 水平， 升高SOD活力，提示血必净注射液对内毒素引起的氧自由基损伤具有修复作用，其抗氧化作用可能与抑制MDA 的释放和升高SOD活性有关。

[1] 段 炼, 魏毅涛， 刘曼玲， 等. 中草药对急性肺损伤的保护机制研究进展[J]. 医学研究生学报, 2016, 29(5): 533-537.

[2] 李 彬, 李淑君. TNF-α和NF-κB在急性肺损伤中的作用机制[J]. 包头医学院学报, 2011, 27(2): 120-121.

[3] 向 红， 王雅莉， 邱 桐， 等. 红芪水提物对急性肺损伤模型大鼠的保护作用[J]. 中国药房, 2014, 25(15): 1352-1354.

[4] Sharawy N, Lehmann C. New directions for sepsis and septic shock research [J].JSurgRes, 2015, 194(2): 520-527.

[5] 李立萍, 张建新, 李兰芳, 等. L-Arg 对LPS 诱导的急性肺损伤大鼠肺表面活性物质和肺泡巨噬细胞功能的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2012, 28(3): 263-266.

[6] 刘海林, 钱燕宁. 丙泊酚联合乌司他丁对内毒素所致大鼠急性肺损伤的保护作用[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, 29(1): 56-62.

[7] 章 斌, 姚永秀, 彭裕红, 等. 吴茱萸碱对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床, 2014, 30(6): 35-38.

[8] Zhang Y, Yu JB, Luo XQ,etal. Effect of ERK1/2 signaling pathway in electro-acupuncture mediated up-regulation of heme oxygenase-1 in lungs of rabbits with endotoxic shock[J].MedSciMonit, 2014, 20(8): 1452-1460.

[9] Chua LS. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities[J].JEthnopharmacol, 2013, 150(3): 805-817.

[10]Chen S, Zheng S, Liu Z,etal. Endogeous sulfur dioxide protects against oleic acid-induced acute lung injury in association with inhibition of oxidative stress in rats[J].LabInvest, 2015, 95(2): 142-156.

[11]Shohrati M, Karimzadeh I, Saburi A,etal. The role of N-acetylcysteine in the management of acute and chronic pulmonary complications of sulfur mustard: a literature review[J].InhalToxicol, 2014, 26(9): 507-523.

[12]Xue M, Sun Z, Shao M,etal. Diagnostic and prognostic utility of tissue factor for severe sepsis and sepsis-induced acute lung injury[J].JTranslMed, 2015, 13(5): 172.

[13]Gokcinar D, Ergin V, Cumaoglu A,etal. Effects of ketamine, propofol, and ketofol on proinflammatory cytokines and markers of oxidative stress in a rat model of endotoxemia-induced acute lung injury [J].ActaBiochimPol, 2013, 60(3): 451-456.

Protective effects of xuebijing on the acute lung injury in rats

LUO Peng1， ZHOU Zhen-xing2△

(1. Emergency Department of Tianjin Dongli Hospital， Tianjin 300300； 2. Department of Clinical Laboratory, Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100010, China)

Objective: To investigate the protective effects of xuebijing (Traditional Chinese Medicine)on the acute lung injury in rats. Methods: Sixty Wistar rats were randomly divided into normal control group，model group，dexamethasone (10 mg/kg) group, xuebijing low-dose，medium-dose and high-dose groups(5, 10, 15 ml/kg)，10 rats in each group. The acute lung injury model was induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide 5 mg/kg. They were given relevant medicines intraperitoneally after modeling，once a day，for consecutive 7 days. Normal control group and acute lung injury(ALI) model group were given the equal bulk of saline by tail vein. 7 days after treatment, the arterial blood samples were collected for detecting the arterial oxygen tension (PaO2) and the serum levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD). Pulmonary tissue samples were obtained for the measurement of lung index(LI), wet/dry weight ratio(W/D), moisture content of lung [(W-D)/W] and the expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-10 (IL-10) and high mobility group protein B1(HMGB1). Results: Compared with normal control group，the levels of LI，W/D，(W-D)/W and PaO2and the expressions of TNF-α, HMGB1 protein and the serum level of MDA in model group were increased，while the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD were decreased；there was statistical significance(P<0.01). Compared with model group，the levels of LI，W/D，moisture content of lung and the protein expressions of TNF-α and HMGB1 and the serum level of MDA in xuebijing groups were decreased significantly，while PaO2and the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD were increased, there was statistical significance (P<0.01).The effects in xuebijing high-dose group were better than those in xuebijing middle-dose and low-dose groups (P<0.01,P<0.05), Conclusion: Xuebijing could alleviate lipopolysaccharide-induced ALI，and its pharmacological mechanism may be related to down-regulation the protein expressions of TNF-α and HMGB1 and the serum level of MDA and up-regulation the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD and the high-dose is more effective.

Xuebijing injection; lipopolysaccharide; acute lung injury; TNF-α; IL-10; HMGB1

2016-06-16

2016-12-08

R563

A

1000-6834(2017)02-132-04

△【通讯作者】Tel: 18201048920; E-mail: zzx0406@126.com