鹿茸多肽对去卵巢大鼠骨质疏松预防作用的研究

龚 庆， 赵文海， 宋秋莹，尹宏兵，冷向阳

(长春中医药大学附属医院 骨科，吉林 长春130021)

*通讯作者

鹿茸多肽对去卵巢大鼠骨质疏松预防作用的研究

龚 庆， 赵文海， 宋秋莹，尹宏兵，冷向阳*

(长春中医药大学附属医院 骨科，吉林 长春130021)

骨质疏松症是一类以骨量减少、骨组织微观形态退化为特征的代谢性疾病，绝经后妇女为骨质疏松症的高发人群。患骨质疏松症后，骨组织强度降低，增高了骨折发生的风险，同时也会引起骨质疏松疼痛，以腰部疼痛尤为严重，极大地影响了患者的生活质量、消耗了医疗资源[1]。骨质疏松症已成为全球性的公共健康问题。鹿茸是脊索动物门哺乳纲鹿科梅花鹿或者马鹿雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，鹿茸多肽是鹿茸中提取的主要活性成分，体外细胞实验发现鹿茸多肽具有刺激成骨细胞增殖分化的作用[2,3]。本实验将探究低、中、高剂量鹿茸多肽对于去卵巢大鼠血清骨代谢指标、股骨骨密度、股骨力学指标、股骨微观形态的影响作用，探究鹿茸多肽对于去卵巢骨质疏松的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

动物与药品:Wistar大鼠48只，雌性，清洁级，体重量 180±10 g (由长春中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(吉)2012-0005)；鹿茸多肽样品(长春中医药大学)；阿仑膦酸钠片，规格：6片/盒，10mg/粒(石药集团欧意药业有限公司)。

试剂:钙(Ca2+)测试盒(碧云天生物技术有限公司，批号：20152824)；碱性磷酸酶(ALP)测试盒(碧云天生物技术有限公司，批号：20153463)。酸性磷酸酶(ACP)测试盒(碧云天生物技术有限公司，批号：20158235)；骨钙素(OC)放射免疫分析药盒(碧云天生物技术有限公司，批号：20157235)。

仪器:PUS-2018G半自动生化分析仪(普朗医疗科技公司)；BI-2000图象分析系统，成都泰盟科技有限公司)；美国 HOLOGIC discovery WA 骨密度测定仪；CSS-44100生物力学测试仪(长春试验机研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 取雌性Wistar大鼠48只，应用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，常规消毒铺单，其中40只摘除双侧卵巢，其余8只在相同位置做切口而不摘除卵巢作为假手术组。术后腹腔注射青霉素钠10万单位/只，连续3天给予10万单位/只。术后15天，将摘除卵巢大鼠随机分为模型组、阿仑膦酸钠(阳性药)组、鹿茸多肽低、中、高剂量组，每组8只。

1.2.2 药物剂量设计 阳性对照药阿仑膦酸钠临床用量10 mg/人/日，即0.14 mg/kg(人均体重按70 kg计)，折算成大鼠的等效剂量为24 mg/kg，作为该试验阳性对照药阿仑膦酸钠的剂量行灌胃给药。鹿茸中国药典生药推荐量为2 g/d，生药中鹿茸提取率为0.9%，换算成大鼠的鹿茸多肽每日等效剂量为45 mg/kg。设鹿茸多肽低、中、高剂量分别为90 mg/kg,45 mg/kg，22.5 mg/kg。模型组、假手术组给予等容量的蒸馏水。以上各组进行每日灌胃，连续灌胃3个月。

1.2.3 标本采样 末次给药后8 h开始禁食(自由饮水)，末次给药后24 h，用6%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)后由腹主动脉取血，3 000 转/min离心5 min，取血清。处置后取左、右两侧股骨。

1.2.4 指标检测 血清生化指标检测：应用PUS-2018G半自动生化分析仪测血清中Ca2+、ACP、ALP、OC含量。股骨BMD测定：所有组别均进行股骨骨密度测定。具体步骤为：取左侧股骨，按美国 HOLOGIC discovery WA 骨密度测定仪的说明书的操作步骤，将股骨放在骨密度测定仪的投影区，进行扫描，获取骨密度数据。股骨生物力学检测：取左侧股骨，使用CSS-44100生物力学测试仪在跨距20 mm、速度5 mm/s的条件下测量其最大弯曲力、断裂挠度的生物力学指标。骨结构光镜观察：取右侧股骨用10%甲醛固定，脱钙，常规石蜡包埋，切片，常规HE染色，采用BI-2000图象分析系统拍取骨皮质，骨小梁静态图像，并测量图像中骨皮质平均厚度和骨小梁面积。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 血清生化指标结果

如表1所示，与模型组相比，鹿茸多肽各剂量组均对血清钙离子水平有升高作用，且高剂量鹿茸多肽升高血清Ca2+[(2.572±0.183)mmol/L]的效果优于中[(2.535±0.220)mmol/L]、低剂量组[(2.524±0.289)mmol/L]，同时也优于阳性对照组[(2.497±0.251)mmol/L]；低、中、高剂量鹿茸多肽均可以降低血清ALP、ACP和OC，阳性对照组(P<0.05)。

2.2 股骨BMD、骨力学测量结果

如表2所示，鹿茸多肽高[(0.221±0.012)g/cm3]、中[0.228±0.015)g/cm3]、低[(0.221±0.012)g/cm3]剂量组相比模型组[(0.212±0.018)g/cm3]均可以明显增高股骨BMD值(P<0.05)，而鹿茸多肽各剂量组间比较则未见显著差异(P>0.05)。在力学测试中发现，鹿茸多肽各剂量组均可以增加股骨力学性能,而高剂量鹿茸多肽对于增加最大弯曲力[110.11±9.341)N]和断裂挠度[3.511±0.521)mm]作用最强，且鹿茸多肽对股骨断裂挠度增加量甚至高于假手术组和阳性对照组。

表1 鹿茸多肽对骨质疏松大鼠(去卵巢模型)血清生化指标的影响±s，n=8)

注：与假手术组比较：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；与模型组比较：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

表2 鹿茸多肽对骨质疏松大鼠(去卵巢模型)骨密度、骨力学、骨皮质厚度、骨小梁面积的影响±s，n=8)

注：与假手术组比较：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；与模型组比较：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3 股骨骨微观形态观察测量

股骨微观结构如图1和图2所示，通过对微观结构下股骨骨皮质厚度和骨小梁面积进行观察测量发现，与模型组相比， 阳性对照组增加股骨皮质厚度[(249.7±24.55对183.3±37.70) μm，P<0.01)]和骨小梁面积[(65624.3±15042.9对28424.4±9034.8) μm3，P<0.01)]具有显著作用，鹿茸多肽各剂量组效果虽然不如阳性对照组，但仍可以显著改善股骨骨皮质厚度增厚和骨小梁面积(P<0.05)。

3 讨论

骨质疏松症是一类代谢性骨病，其病理特征为骨量减少、骨皮质变薄及骨小梁数量减少。患骨质疏松症后，骨组织力学强度严重下降，极大地增加了骨折的风险。同时，骨质疏松症也会导致以腰背疼痛为主骨质疏松疼痛，严重影响患者的生存质量。绝经后女性由于雌激素缺乏，是骨质疏松症的高发人群。

鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，《本草纲目》中记载鹿茸具有“善于补肾壮阳，生精益血，补髓健骨”的功效。鹿茸多肽为鹿茸中主要的活性物质，近年来关于鹿茸多肽的多种药理活性已经有了证实，如促进伤口皮肤愈合、提高机体免疫力、促进神经损伤再生、保护心肌细胞、修复软骨损伤等[4-7]。吕秀华等在体外实验中验证了鹿茸多肽可以促进M3T3-E1细胞增殖和成骨方向表达[8]；赵长伟等通过临床观察发现骨质疏松患者服用鹿茸多肽后骨质疏松临床症状发生明显好转[9]。本研究在构建大鼠去卵巢骨质疏松模型后，利用动物实验分析鹿茸多肽对于骨质疏松治疗情况，并将治疗组分为3种剂量，评价鹿茸多肽对于骨质疏松症的最佳治疗剂量。

注：放大倍数：400×；A为模型组；B为阳性对照组；C为假手术组；D为鹿茸多肽低剂量组；E为鹿茸多肽中剂量组；F为鹿茸多肽高剂量组。

注：放大倍数：400×；A为模型组；B为阳性对照组；C为假手术组；D为鹿茸多肽低剂量组；E为鹿茸多肽中剂量组；F为鹿茸多肽高剂量组。

血清Ca2+、ALP、ACP和OC是机体骨转换代谢的典型标志物，通过其数值的变化可以判断机体骨代谢水平[10]。研究发现，给予鹿茸多肽后，血清钙水平明显升高，提示鹿茸多肽利于机体对钙离子吸收。而血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨钙素在给药后均有下降的作用，说明鹿茸多肽有着抑制破骨细胞活性、减少骨吸收破坏的作用。

股骨BMD、骨力学强度是评价骨质疏松严重程度的最重要指标，BMD、骨力学强度的改善使得骨质疏松患者骨折风险大大减小，明确提升了患者生活生存质量。鹿茸多肽显著促进骨组织生长，利于骨沉积作用，增加了骨密度和骨力学性能。观察骨微观形态可以最直观的评价骨质疏松情况，骨质疏松的重要病理特征为骨量的减少，通过显微镜下观察测量股骨皮质厚度和骨小梁面积而判断骨量情况。鹿茸多肽可以增加骨皮质厚度和骨小梁面积，说明其有着良好的改善骨质，预防骨质疏松的作用。

本实验结果表明,鹿茸多肽对去卵巢大鼠骨质疏松症模型有显著的预防作用， 研究中所检测的各项指标与临床骨质疏松患者情况平行，可考虑将实验成果进行临床转化。在我们的研究中尚未涉及鹿茸多肽对于骨质疏松症预防作用的机制研究，后续研究中我们将进行相关的实验。

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1007-4287(2017)05-0890-04

2016-08-27)