染色质解旋酶DNA结合蛋白7表达与肝癌临床病理特征及预后的关系

陈 颖,邓周峰,江卫华,周 嘉,苏明琪,韩 骏,张 辉*

(1.上海交通大学医学院附属同仁医院 肿瘤科，上海200336；2.上海交通大学医学院附属同仁医院 肝胆外科，上海200336；3.第二军医大学附属东方肝胆医院 肝外三科，上海200438)

染色质解旋酶DNA结合蛋白7表达与肝癌临床病理特征及预后的关系

陈 颖1,邓周峰1,江卫华1,周 嘉2,苏明琪2,韩 骏3,张 辉2*

(1.上海交通大学医学院附属同仁医院 肿瘤科，上海200336；2.上海交通大学医学院附属同仁医院 肝胆外科，上海200336；3.第二军医大学附属东方肝胆医院 肝外三科，上海200438)

目的 通过研究肝癌组织内染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)的表达及其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系，探讨CHD7作为肝癌预后预测指标的可行性。方法 将286例肝切除术后病理确诊为肝细胞肝癌的标本制作成组织芯片。采用免疫组化法检测肝癌及癌旁肝组织中CHD7的表达水平，分析其与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系。结果 免疫组化结果显示CHD7在肝癌组织中表达明显高于对应的癌旁肝组织。CHD7高表达与肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、肿瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相关，与肝癌患者术后总体生存率呈负相关，而与肝癌患者术后复发率呈正相关。结论 CHD7在肝癌中明显高表达，可作为肝癌患者预后的独立预测指标之一。

肝细胞肝癌 (HCC)；染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)；预后；组织芯片

(ChinJLabDiagn,2017,21:0761)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是致死率最高的恶性肿瘤之一[1]。随着围手术期处理方法、外科切除、肝移植以及部分辅助疗法的成熟，肝癌五年生存率有了一定程度的提高[2]。但是，肝癌术后复发，肝内、肝外转移的风险仍较大[3,4]。因此，全面了解肝癌复发与转移的分子生物学机制，寻找对预后和治疗有指导意义的分子标记非常重要。

染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)是染色质解旋酶DNA结合蛋白家族中的一种，为ATP依赖型的染色质重塑体，其生物学功能多与人先天性畸形相关，并且在小细胞肺癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达和活化，调控肿瘤细胞增殖、侵袭等功能[5-7]。本研究通过组织芯片行免疫组化明确286例行根治性切除术的肝细胞癌患者肿瘤相关组织中CHD7的表达情况，分析CDH7与肝癌患者临床特征及预后之间的关系，探讨CHD7在肝癌中的表达差异及作为肝癌预后预测指标的可行性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2006-2011年在上海交通大学医学院附属同仁医院就诊的行肝癌根治性切除患者286例，所有患者均经病理诊断确诊为肝细胞肝癌，每位患者的组织标本取癌与癌旁各2个点。所有患者术后均复查甲胎蛋白(alpha -fetal protein，AFP)、B超(3年内每3个月一次，3年以后每半年一次)，磁共振(每年一次)，以监测肿瘤有无复发转移。如果出现复发转移则根据患者一般情况、肿瘤的大小、位置及肝外转移情况评估后行再次手术或介入、放射、射频消融等治疗。所有患者随访时间至2016年6月，标本收集经上海交通大学医学院附属同仁医院医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学染色(IHC)

免疫组化试剂盒购自基因科技(上海)有限公司。组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作，常规烘烤切片，依次经二甲苯、酒精处理脱蜡后PBS清洗、经H2O2灭活内源性过氧化物酶及柠檬酸修复抗原处理，加CHD7抗体(美国Abcam 公司，1∶200稀释)4℃度孵育过夜，二抗37℃孵育0.5 h，PBST清洗后DAB显色液显色，苏木精复染、封片。

1.3 免疫组化结果判读

由两位病理科医师双盲方式独立评分，棕黄色颗粒状沉积物为阳性。按阳性染色细胞数占总细胞数百分比分4级：无阳性染色细胞为0分，≤34%阳性细胞数为1分，阳性细胞数量在34%-66%之间为2分，≥66%以上阳性细胞数为3分。按照染色强度分为4个等级分别为：无染色为0分,弱阳性1分，中度阳性2分，强阳性3分。综合阳性染色细胞数评分和染色强度评分(两项相乘)，0-6分为CHD7低表达(CHD7 low)，>6分为CHD7高表达(CHD7 high)。

1.4 统计学处理

利用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)进行统计分析。CHD7表达情况与其他临床病理特征之间关系用Pearson卡方检验验证。绘制总生存和复发的Kaplan-Meier生存曲线，并对其进行Log-rank检验。用单因素和多因素分析研究各因素对预后的影响。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 CHD7在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况

为了解CHD7在肝癌组织中的表达情况，对286例根治性肝细胞癌切除术后患者癌及癌旁肝组织制成的组织芯片行免疫组织化学染色，结果显示CHD7蛋白定位于肿瘤及正常肝组织的细胞核内，CHD7在肝癌组织中的表达明显高于对应癌旁正常肝脏组织(63%vs12%，P<0.05)，见图1。

图1 CHD7在肝癌组织及癌旁组织中的免疫组化染色结果(×100)

2.2 CHD7在肝癌组织中表达与肝癌临床病理特征的关系

在286例患者中，肝癌组织中CHD7表达与肿瘤数目(P=0.004)、肿瘤包膜完整性(P=0.012)、肿瘤血管侵犯(P=0.026)、TNM分期(P=0.03)及BCLC分期(P=0.04)密切相关，而与患者的性别(P=0.21)、年龄(P=0.797)、AFP(P=0.467)、肝硬化(P=0.399)及肿瘤大小(P=0.906)均无关。CHD7蛋白在肝癌的表达情况及与患者临床病理参数之间的关系见表1。

2.3 CHD7在肝癌组织中表达与患者预后的相关性

应用Kaplan-Meier生存曲线研究CHD7表达与HCC患者预后的相关性，286例患者均获得随访资料，Kaplan-Meier生存权限分析显示CHD7 high(n=180)组的总生存率明显低于CHD7 low组(n=106)(P=0.0347),而肝癌肿瘤的复发率CHD7 high组(n=180)则高于CHD7low组(n=106)(P=0.0291)，见图2。

表1 CHD7的表达与肝癌临床病理因素之间的关系

#χ2test

COX比例风险回归模型进行单因素分析结果显示：CHD7表达(P=0.038)、肿瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P<0.001)、肿瘤大小(P<0.001)及肿瘤数目(P<0.001)是HCC患者总生存的不良因素，而CHD7表达(P=0.032)、肿瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P=0.001)、肿瘤大小(P<0.001)及肿瘤数目(P<0.001)是HCC患者肿瘤复发的不良因素。COX逐步回归的多因素分析结果表明CHD7高表达可以作为预测HCC患者不良预后的独立因素，见表2,3。

3 讨论

外科手术切除是肝细胞癌治疗的首选及最主要的治疗手段[8]。随着外科手术技术的发展与成熟，肝癌的切除率逐渐提高。但由于长期受到环境与基因交互作用，肝细胞癌术后复发及转移率仍然较高，多数患者预后较差[9-11]。筛查术后高危复发人群并及时干预，是降低复发、转移率，提高肝癌手术切除疗效的关键。虽然目前研究已揭示了部分肝细胞癌相关的原癌基因与抑癌基因，但对于其复发与转移的分子生物学机制与通路仍了解有限[12,13]。因此，探究可以有效鉴定复发及转移风险的分子标记来预测患者的生存风险并指导治疗方案十分必要。

图2 CHD7在癌组织中高低表达的总体生存率和复发率

表2 患者总生存期的单因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

表3 患者肿瘤复发的单因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

染色质解旋酶DNA结合蛋白家族属于ATP依赖的染色质重组SNF2超家族，由9个蛋白组成(CHD1-CHD9)。该家族蛋白以N端相同的染色质串联域以及ATP依赖的解螺旋酶区域为特点。N端染色质域可识别并结合核小体，介导染色质相互作用。而ATP依赖的解螺旋酶区域参与转录、复制、重结合、DNA修复等细胞核生物学功能。因此CHD家族蛋白广泛参与正常的细胞、组织发展过程，其突变与多种疾病密切相关[14-17]。CHD7具体的功能目前仍处于研究状态，多与染色质重塑相关。在目前的研究中，突变的CHD7可引起严重的多系统器官异常的CHARGE综合征，致死率较高[7,15]。CHD7在多种肿瘤的发生发展过程中也起到重要作用。Pleasance等[5]研究发现，CHD7在非小细胞型肺癌中重排列，与细胞损伤修复异常相关，对肺癌的进展有一定促进作用。在Lauren E.Colbert等[6]的研究中，降低CHD7的表达可提高胰腺癌病人术后无复发生存率与总体生存率，并可作为胰腺导管腺癌预后评价的分子标记。综上说明，CHD7对肿瘤的进展和转移起到重要的促进作用。目前我们的研究发现CHD7在肝癌组织中的表达明显高于癌旁非癌组织，肝癌组织中CHD7表达与肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、肿瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相关。与此同时，通过Kaplan-Meier分析发现CHD7高表达的HCC患者预后明显较差，而低表达的HCC患者预后相对较好，提示CHD7与HCC患者预后紧密相关，进一步的COX逐步回归的多因素分析证明了CHD7是预测HCC患者预后的独立因素之一，因此我们推测CHD7可以作为预测HCC患者独立预后的分子标记。

总之，CHD7在肝癌组织中呈高表达，其表达水平与肿瘤的不良临床病理特征密切相关；CHD7的高表达是肝癌根治性切除术后的总体生存率和无瘤生存率的独立预后因素之一，可以作为肝癌患者预后的预测指标。通过对肝癌组织中CHD7的检测，及时发现高危复发患者，有助于实现肝癌的个体化治疗，可有效降低复发率，提高长期生存时间。

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Correlation of chromodomain helicase DNA binding protein 7 expression with clinical and pathological characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma

CHENYing,DENGZhou-feng,JIANGWei-hua,etal.

(DepartmentofOncology,TongrenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China)

Objective To explore the clinical significance of chromodomain helicase DNA binding protein 7(CHD7) expression in hepatocellular carcinoma(HCC)and association between CHD7 expression and survival in HCC patients．Methods With the use of immunoreactivity,CHD7 expression and its correlation with other clinicopathological characteristics were examined in a tissue microarray that contains samples from 286 HCC patients．Results HCC tissues expressed markedly higher levels of CHD7 than did adjacent non-tumor tissues,overexpression of CHD7 significantly correlates with tumor number，capsular formation，microvascular invasion,TNM Stage,BCLC Stage and shorter overall survival with higher recurrence rates in HCC patients after curative resection．Conclusion The expression levels of CHD7 in HCC are significantly higher，may be an independent prognostic factor for HCC patients．

hepatocellular carcinoma;chromodomain helicase DNA binding protein 7;prognostic;Tissue chip

上海市卫生和计划生育委员会面上项目(201640275)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0761-05

R735.7

A

陈颖，36岁，男，硕士，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的基础和临床研究。

2017-01-17)