猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立和初步应用

高 骏,易建中,李 红,刘成倩,姚惠娟,孙凤萍

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)

猪圆环病毒2型(PCV2)是一种主要引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、新生仔猪先天性震颤(CT)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病的病原体[1]。PCV2还常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒病(PPV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、多杀性巴氏杆菌(PM)、肺炎支原体(MP)等病原体形成混合感染[2-3],对养猪业的危害极大。

吴瑗等[4]对浙江省及周边地区的猪圆环病毒2型(PCV2)进行了分子流行病学的调查,发现PCV2的阳性率在2007—2012年间分别为41.7%、52.0%、44.1%、37.0%、40.5%和33.3%。张智明等[5]对黑龙江多个地区2012—2014年间疑似PCV2的246份感染病料的分子流行病学检测发现,PCV2阳性率为78.46%。以上研究表明,PCV2在我国的大小猪场中普遍存在。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等[6]设计并报道。该技术依赖于Bst DNA聚合酶大片段的置换活性,利用4条特异性引物在60—65℃、1—2 h条件下完成对目标片段序列的等温扩增。LAMP技术最终的扩增产物在电泳后的凝胶上呈现出片段长度不等的梯状条带组,扩增得到的产物可以经过酶切进行验证,也可以无需电泳直接肉眼进行可视化的结果判断。与普通的PCR检测方法相比,LAMP省却了DNA模板的热变性、热循环、电泳及紫外观察等过程,也不需要使用昂贵的PCR仪,使用简单的水浴锅或保温杯即可进行,该方法较适宜满足基层单位的临床快速诊断要求。本研究拟建立有效的PCV2 LAMP检测方法,以期满足基层临床PCV2病原的快速检测。

1 材料与方法

1.1 病毒毒株

猪圆环病毒2型(PCV2)全长阳性质粒DNA及阳性毒株、猪伪狂犬病毒株(PrV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒株(PRRSV)、猪瘟病毒毒株(CSFV)、猪细小病毒毒株(PPV)均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所禽病室分离和保存。

1.2 试剂

TIANamp Virus DNA∕RNA Kit、TIANamp Blood DNA Kit购自天根生化科技有限公司;Bst DNA聚合酶和BpiI(BbsI)内切酶均购自纽英伦(NEB)生物技术(北京)有限公司;MgSO4、甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司;dNTPs、DL 2000 marker等购自大连宝生物工程有限公司;GoldViewTM核酸染料购自上海赛百盛基因技术有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中发布的PCV2全长基因组序列(AY686763),使用LAMP在线引物软件设计工具https:∕∕primerexplorer.jp∕lampv4∕index.html设计1组LAMP引物,FIP引物在3’末端含有与F2c互补的F2区段,BIP引物在3’末端含有与B2c互补的B2区段。两对引物均由铂尚生物技术(上海)有限公司合成,引物序列详见表1。

表1 PCV2 LAMP扩增引物信息Table 1 LAMP primer information for PCV2

1.4 病毒DNA的提取

利用TIANamp Virus DNA∕RNA Kit提取相关病原的DNA和RNA。使用TIANamp Blood DNA Kit提取上海与江苏海门某猪场的疑似PCV2的血样DNA。

1.5 PCV2 LAMP检测方法的建立

对PCV2的LAMP反应体系和反应条件进行优化,反应总体系为25 μL,包括:1)Bst DNA聚合酶(8 U∕μL)1.25 μL;2)Bst缓冲液 2.5 μL;3)DNA 模版(PCV2 全长质粒 DNA)1 μL(0.1 μg∕μL),其他反应组分进行了一定范围的浓度变化;4)MgSO4(0.1 mol∕L)1—3 μL;5)Betaine(5 μmol∕μL)2—8 μL;6)dNTPs(2.5 mmol∕μL)2—8 μL;7)引物 F3(10 μmol∕L)0.2—1 μL;引物 B3(10 μmol∕L)0.2—1 μL;引物 FIP(10 μmol∕L)1—3 μL;引物 BIP(10 μmol∕L)1—3 μL,用纯水调整体积至 25 μL∕管,反应温度按 58 ℃、60℃、62℃、64℃作递增比较,反应时间选择1 h、1.5 h、2 h进行比较。LAMP扩增后的产物经2%琼脂糖电泳后,检测有无梯状多条产物带,最终确定最佳的反应条件。

1.6 PCV2 LAMP产物的酶切验证

取LAMP扩增后的产物10 μL,根据BpiI(BbsI)内切酶说明书,建立30 μL酶切体系,37℃酶切过夜,取10 μL酶切后的产物经2%琼脂糖电泳后检测结果。

1.7 PCV2 LAMP特异性试验

将猪圆环病毒2型(PCV2)全长阳性质粒DNA、猪伪狂犬病毒株(PrV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒株(PRRSV)、猪瘟病毒毒株(CSFV)、猪细小病毒(PPV)的DNA一起进行相同条件下的LAMP扩增,检测所建立的LAMP方法的特异性。

1.8 PCV2 LAMP敏感性试验

将猪圆环病毒2型(PCV2)全长阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后,进行LAMP扩增,将LAMP扩增后的产物进行2%琼脂糖电泳,检测LAMP方法的敏感性。

1.9 PCV2 LAMP检测方法的初步应用

对上海和江苏海门2个猪场采集的疑似PCV2的36份血样提取DNA后,用建立的LAMP方法进行检测,统计阳性结果,并与PCR方法比较两者的符合度。

2 结果与分析

2.1 PCV2 LAMP检测方法的建立

优化后的反应体系为Bst DNA聚合酶(8 U∕μL)1.25 μL、 Bst缓冲液 2.5 μL、PCV2 DNA 模版1 μL(0.1 μg∕μL)、MgSO4(0.1 mol∕L)3 μL、Betaine(5 μmol∕μL)5 μL、dNTPs(2.5 mmol∕μL)3 μL、引物 F3(10 μmol∕L)0.4 μL、引物 B3(10 μmol∕L)0.4 μL、引物 FIP(10 μmol∕L)2.5 μL、引物 BIP(10 μmol∕L)2.5 μL,用纯水调整体积至25 μL∕管。最佳反应温度和时间分别为62℃和1.5 h。

此次建立的PCV2 LAMP扩增方法能够检测到PCV2全长质粒DNA以及PCV2阳性组织样本中提取的DNA,且空白对照符合预期(图1)。对LAMP扩增后的产物进行BpiI(BbsI)酶切验证,得到预期的196 bp和97 bp 2个条带,表明建立的PCV2 LAMP扩增的产物是符合引物设计预期的(图2)。特异性试验表明:从各种检测的猪病原体DNA或RNA中只能扩增到PCV2的阳性LAMP梯度条带,其他病原体核酸检测均为阴性,表明建立的PCV2 LAMP检测方法具有较好的特异性(图3)。通过敏感性试验,将PCV2全长质粒DNA模板10倍稀释(1—1×10-6ng)后进行LAMP扩增,显示建立的PCR方法最低能够检测到1×10-3ng(1 pg)的PCV2 DNA(图4)。

图1 LAMP方法检测PCV2病毒DNAFig.1 Detection of PCV2 DNA by LAMP

图2 LAMP扩增产物的酶切验证Fig.2 Verification of LAMP amplification products by enzyme digestion

图3 PCV2 LAMP方法特异性比较Fig.3 Comparison of the specificity of PCV2 LAMP

图4 PCV2 LAMP敏感性试验Fig.4 Sensitivity tests of PCV2 LAMP method

2.2 PCV2 LAMP检测方法的可视化结果判定及临床检测的初步应用

2.2.1 PCV2 LAMP检测方法的可视化结果判定

由于LAMP扩增合成时,从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子会与反应溶液中的镁离子反应,产生大量白色的焦磷酸镁(Mg2P2O7)沉淀,因此可以通过肉眼观测反应后试管内液体的浑浊度作为判定阳性与否的指标。本研究建立的方法可以通过肉眼观察反应后的PCR管内液体的浑浊度来区分阳性结果(图5)。

2.2.2 PCV2 LAMP检测方法的初步应用

对上海和江苏海门2个猪场采集的疑似PCV2的36份血样进行检测,结果表明:阳性样本数为19份,阳性率为52.8%。将这19份LAMP阳性样本通过本研究室前期建立的PCV2的PCR诊断方法[7]进行验证,其中18份检测显示PCR阳性,两者的阳性符合率为94.7%,表明LAMP检测方法具有较高的灵敏度,对于生产基地的临床检测具有较好的适用性,同时也表明目前PCV2感染在上海及周边地区的猪场中广泛存在。

图5 PCV2 LAMP可视化结果Fig.5 Visualization results of PCV2 LAMP

3 讨论

猪圆环病毒2型(PCV2)感染仅通过症状很难做出准确的临床诊断,而且该病原往往与其他猪病原体混合感染,导致感染猪出现多种病理性的临床症状。

目前,对于该病原体最主要的实验室诊断技术是PCR和ELISA方法[8]。前者根据PCV2的基因序列设计引物,并通过PCR方法扩增到目标基因片段,并可通过电泳、酶切或测序等方法来验证试验结果。本实验室早期曾建立了PCV2的PCR诊断方法,该方法准确、快速,但主要局限是需要有PCR仪、电泳仪器、紫外凝胶成像系统等设备才能进行诊断操作,并不适合基层临床进行快速诊断。而ELISA方法主要是通过检测猪血清中的PCV2抗体水平,来诊断是否有PCV2的感染。虽然ELISA方法较为适合猪群的PCV2抗体水平监测,但ELISA方法属于血清学检测,结果的判定标准较难划定,容易出现一些假阳性。LAMP方法的优点是可以不需要复杂精密的仪器,只需要在水浴锅或保温杯中就可完成试验的操作。LAMP方法较PCR方法有更高的灵敏度,而且方便的可视化结果判定更适合基层单位的临床使用。

在本研究过程中,注意到LAMP方法中体系内的内外引物的比例以及Mg2+浓度的优化比较重要,对于不同的LAMP引物需要对反应体系和反应温度进行不同的优化以达到最佳的反应条件。同时,本研究也发现,由于LAMP方法的高灵敏度,也容易出现一定的假阳性,特别是在操作过程中容易发生气溶胶污染,尤其是移液器、枪头容易交叉污染,所以在进行LAMP过程中,如发现污染,要对实验台、移液器、PCR管等耗材进行彻底消毒或高压处理后方可重新进行试验。

[1]CHAE C.A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases[J].Vet J,2005,169(3):326-336.

[2]KIM J,CHUNG H K,CHAE C.Association of porcine circovirus 2 with porcine respiratory disease complex[J].Vet.J,2003,166(3):251-256.

[3]WANG L,GE C,WANG D,et al.The survey of porcine teschoviruses,porcine circovirus and porcine transmissible gastroenteritis virus infecting piglets in clinical specimens in China[J].Tropical animal health and production,2013,45(5):1087-1091.

[4]吴瑗,章红兵,王鑫炎,等.2007—2012年浙江省及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)分子流行病学调查[J].农业生物技术学报,2013,21(4):456-463.

[5]张智明,王全杰,窦海燕,等.2012年—2014年黑龙江省部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查[J].动物医学进展,2015,36(10):119-123.

[6]NOTOMI T,OKAYAMA H,MASUBUCHI H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[7]高骏,胡建华,孙凤萍,等.猪圆环病毒Ⅱ型核酸诊断方法的建立和初步应用[J].上海农业学报,2007,23(4):102-104.

[8]崔尚金,李曦,符芳,等.猪断奶后多系统衰竭综合征诊断方法及标准的建立[J].中国兽医科技,2003,33(11):68-72.