黑枸杞不同溶剂提取物抗氧化活性

崔施展，谢晓亮，贾东升，李荣乔，温春秀，刘灵娣，韩进现

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

黑枸杞不同溶剂提取物抗氧化活性

崔施展，谢晓亮*，贾东升*，李荣乔，温春秀，刘灵娣，韩进现

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

探究黑枸杞不同溶剂提取物体外抗氧化活性。分别以水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯，制备不同溶剂提取物，测定各提取物中总酚、黄酮含量，比较不同溶剂提取物体外抗氧化活性，并分析活性物质含量及抗氧化能力的相关性。结果表明，50%乙醇提取物总酚、黄酮含量均最高，对DPPH、ABTS+自由基的清除能力及铁离子还原能力最强，总酚含量与抗氧化活性具有较高的相关性。黑枸杞50%～75%乙醇提取物抗氧化活性相对较高。

黑枸杞；抗氧化活性；提取溶剂；总酚；黄酮

人体在新陈代谢过程中会产生大量的活性氧（ROS），包括超氧阴离子自由基、羟自由基等氧自由基，氧自由基具有强氧化性，具有一定的细胞毒性，过度积累会造成机体组织及细胞损害[1]。抗氧化剂具有清除氧自由基，增强机体免疫力等功能，但长期使用人工抗氧剂存在致畸、致癌等风险[2]。黑枸杞具有较高的食用及营养价值，近年来受到人们的广泛关注，利用黑枸杞制备安全高效、纯天然的抗氧化剂，对体内清除自由基，增强免疫力具有积极意义[3]。本研究比较了黑枸杞不同溶剂提取物的抗氧化活性，并对功效物质与抗氧化能力相关性进行了分析，为黑枸杞相关功能食品研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DGX-92438-2型干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；FA2004型电子分析天平：上海恒平科学仪器有限公司；YRE-301旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；FC-10A冷冻干燥机：河北国辉实验仪器有限公司；UV-6100S型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HBS-1096A酶标仪：南京德铁实验设备有限公司。

黑枸杞：采摘于河北省农林科学院实验园；没食子酸（批号：201603110831）、芦丁标准品（批号：201608100080）：上海纯优生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂、DPPH、ABTS：购自美国Sigma；水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物的制备

取新鲜黑枸杞55℃干燥，精密称取黑枸杞100 g，按照1∶35（g/mL）加入不同提取溶剂，回流提取3次，2 h/次，减压浓缩，冷冻干燥即得不同溶剂提取物。

1.2.2 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量[4]。没食子酸标准曲线的绘制：精密称取没食子酸标准品20.0 mg，加入50%甲醇溶液8 mL，制备标准品溶液。精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50%甲醇定容至1.0 mL，得系列标准品溶液，取系列标准品溶液0.2 mL，50%Folin-Ciocalteu试剂2.0 mL，0.2 g/L碳酸钠溶液4.0 mL，蒸馏水定容至10.0 mL，25℃避光孵育2 h，760 nm处测定吸光值。以吸光值为X轴，没食子酸浓度为Y轴，拟合回归方程：Y=12.347X+1.372（R2= 0.997 1），在2.0 μg/mL～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。总酚含量测定：精密量取样品溶液0.1 mL，按照以上操作，测定样品总酚含量。

1.2.3 黄酮含量测定

采用三氯化铝显色法[5]。芦丁标准曲线绘制：精密称取芦丁标准品20 mg，加入50%甲醇溶液10 mL，制备标准品溶液。精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50%甲醇定容至1.0 mL，得系列对照品溶液，吸取系列标准品溶液1 mL，0.1 g/L AlCl3200 μL，1 mol/L醋酸酐200 μL，加蒸馏水至6.0 mL，室温放置30 min，415 nm处测定吸光值。以吸光值为X轴，芦丁浓度为Y轴，拟合回归方程：Y=54.32X+0.187（R2= 0.999），在4.17 μg/mL～27.78 μg/mL范围内线性关系良好。黄酮含量测定：精密量取样品溶液0.1 mL，按照以上操作，测定样品黄酮含量。

1.2.4 DPPH自由基清除能力[6]

将黑枸杞不同溶剂提取物分别配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，取各浓度样品溶液2.0 mL，加入0.09 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，避光放置30 min，以2.0 mL乙醇作为空白对照，517 nm处测定吸光值，按式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白吸光度；As为样品吸光度。

1.2.5 ABTS+自由基清除能力[7]

将黑枸杞不同溶剂提取物分别配制成0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，称取K2S2O40.050 4 g，加入7 mmol/L ABTS溶液100 mL，避光放置16 h。取各浓度样品溶液1.0 mL，ABTS反应液1.5 mL，50%甲醇2.5 mL，放置2 min后，745 nm处测定样品吸光值，1.0 mL蒸馏水作为空白对照，按式（2）计算ABTS+自由基清除率。

式中：A0为空白吸光度；As为样品吸光度。

1.2.6 FRAP法测定抗氧化能力[8]

取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4溶液300μL，加入9mLFRAP试剂，37℃水浴10min，593nm处测定吸光值，以吸光值为X轴，FeSO4浓度为Y轴，拟合回归方程。配制不同浓度黑枸杞提取物溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，按照以上操作，测定样品吸光值。样品抗氧化活性以相同吸光度所需FeSO4表示，FRAP值越大表明抗氧化活性越高。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，数据资料用平均数±标准差（±s）表示，各组间差异显著性采用ANOVA检验，组间差异比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同溶剂提取物总酚及黄酮含量

不同溶剂提取物总酚和黄酮含量见表1。

表1 不同溶剂提取物中总酚和黄酮含量（±s）Table 1Contents of total phenolics and flavonoids in extracts of different solvents

表1 不同溶剂提取物中总酚和黄酮含量（±s）Table 1Contents of total phenolics and flavonoids in extracts of different solvents

注：同一列字母不同表示差异显著，P<0.05。

提取溶剂总酚含量/（mg/g）黄酮含量/（mg/g）水147.26±1.57a70.54±8.66a50%乙醇254.38±1.29b155.31±16.37b75%乙醇214.33±0.98c184.69±15.77b乙醇156.73±0.99d93.21±12.14c正丁醇89.66±0.87e62.31±8.54a乙酸乙酯82.63±0.79f58.35±7.62a

黑枸杞不同溶剂提取物总酚和黄酮含量具有较大差异。50%乙醇提取物总酚含量最高为（254.38± 1.29）mg/g，乙酸乙酯提取物总酚含量最低；75%乙醇提取物黄酮含量最高，为（184.69±15.77）mg/g，其次为50%乙醇（155.31±16.37）mg/g。

2.2 不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力

不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力结果见图1。

图1 不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力Fig.1Scavenging ability of DPPH free radical by different solvent extracts

不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力在一定浓度范围内0.1 mg/mL～0.6 mg/mL呈线性关系，随着浓度的增加，清除能力增强，清除能力依次为：水提取物＞50%乙醇提取物＞70%乙醇提取物＞乙醇提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

2.3 ABTS+自由基清除能力

不同溶剂提取物清除ABTS+自由基能力结果见图2。

图2 不同溶剂提取物清除ABTS+自由基能力Fig.2Scavengingability of ABTS+radical by different solvent extracts

不同溶剂提取物均具有一定ABTS+清除能力，在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL浓度范围内呈线性关系，对ABTS+清除能力随提取物浓度的增加而升高，乙酸乙酯提取物清除能力最强，不同溶剂提取物清除ABTS+能力依次为：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞乙醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物＞50%乙醇提取物。

2.4 FRAP法测定抗氧化活性

不同溶剂提取物FARP值结果见图3。

FeSO4回归方程：Y=1.232 1X+0.014 5，R2=0.992，在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范围内线性关系良好。黑枸杞不同溶剂提取物的铁离子还原能力随提取物浓度的增加而升高，其中70%乙醇提取物浓度为1.0 mg/mL时活性最强。

图3 不同溶剂提取物FARP值Fig.3FARP value of different solvent extracts

2.5 多酚、黄酮含量与抗氧化活性相关性分析

黑枸杞抗氧化活性与总酚、黄酮含量的相关系数（r）见表2。

表2 黑枸杞抗氧化活性与总酚、黄酮含量的相关性Table 2The correlation of antioxidant activity of black wolfberry with total phenols，flavonoid content

黑枸杞提取物对DPPH、ABTS+自由基清除能力及铁离子还原能力与总酚含量呈正相关，在一定范围内随着总酚含量的升高，抗氧化活性增加；对DPPH和ABTS的抗氧化活性与黄酮含量无明显相关性，铁离子还原能力与黄酮含量呈正相关。

3 结论与讨论

酚类及黄酮类化合物是植物提取物抗氧化活性的主要物质基础[9]，本研究比较了不同提取溶剂提取物的体外抗氧化活性，并测定了不同溶剂提取物中总酚和黄酮含量，分析了总酚和黄酮含量与抗氧化活性的相关性。黑枸杞各溶剂提取物均表现出了较好的抗氧化活性，抗氧化活性与样品浓度呈现一定的剂量效应，总酚含量与抗氧化能力具有显著相关性，黄酮与抗氧化能力无显著相关性，50%～75%乙醇提取物抗氧化活性最强，这与酚类化合物主要为中等极性化合物相一致[10]。本试验对黑枸杞不同溶剂提取物的抗氧化活性进行了研究，筛选了黑枸杞抗氧化活性较强的提取溶剂，为后期黑枸杞的相关开发提供理论参考，但各活性成分间的相关性及是否存在相互作用，有待进一步探究。

参考文献：

[1]刘曦,祝连彩,王伯初.蓝莓叶不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2013,34(12)：101-105

[2]吴奇,朱晨星,樊晓兰,等.抗氧化剂与延长寿命的相关性研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2016,30(5)：588-597

[3]张玲艳,王宏权.黑枸杞花青素的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业,2014,35(12)：88-91

[4]周瑞,田呈瑞,高春燕,等.黄参不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2012,33(8)：58-61

[5]杨静毅,喻玲玲,吴梅,等.银合欢果皮总黄酮含量测定及抗氧化活性[J].食品科学,2015,36(8)：187-190

[6]魏雪,张清安,黎梅雨.茶叶冲泡中茶多酚溶出及其对DPPH自由基的清除[J].食品研究与开发,2016,37(6)：1-5

[7]白海娜,王振宇,刘瑞海,等.白藜芦醇与黑木耳多糖协同清除ABTS自由基活性的研究[J].现代食品科技,2014,12(3)：64-68

[8]Manjir,Sarma,Kataki,et al.Garden rue inhibits the arachidonic acid pathway,scavenges free radicals,and elevates FRAP：role in inflammation[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2014,12(3)：172-179

[9]吴慧,卢虹玉,李梅婷,等.亨氏马尾藻醇提取物及其不同溶剂萃取物的抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2016,37(10)：171-175

[10]黄闪闪,李赫宇,王磊,等.苹果多酚抗氧化特性研究进展[J].食品研究与开发,2014,24,(24)：159-162

Antioxidant Activity of Extracts from Different Solvents of Black Wolfberry

CUI Shi-zhan，XIE Xiao-liang*，JIA Dong-sheng*，LI Rong-qiao，WEN Chun-xiu，LIU Ling-di，HAN Jin-xian
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Medicinal Plant Research Center，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

The antioxidant activity of different solvent extracts of black wolfberry was explored.Preparation of water，50%ethanol，75%ethanol，ethanol，n-butyl alcohol，ethyl acetate solvent extract，determination of total phenol and flavonoids content in the extract，comparison of antioxidant activity of different solvent extracts in vitroand the correlation between the content of active substances and antioxidant capacitywereanalyzed.The resultsshowed that，50%ethanol extract of the total phenol，flavonoids were the highest，50%ethanol extract had the strongest scavenging ability to DPPH and ABTS free radical and the ability of iron ion reduction，The content of total phenol had a high correlation with the antioxidant activity.The antioxidant activity of ethanol extract from black wolfberry 50%-75%was relatively high.

Black wolfberry；antioxidant activity；extraction solvent；total flavonoids；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.009

2016-12-13

崔施展（1989—），男（汉），助理研究员，本科，主要从事中药功能食品研究。

*通信作者：谢晓亮（1962—），男，研究员，博士，主要从事中药资源、中药加工研究；贾东升（1982—），男，副研究员，硕士，主要从事中药功能食品研究。