银杏叶片提取物EGB761联合高压氧治疗阿尔茨海默病的疗效分析

朱骏，张丽达，董靖德，卢丽玉，张利丽，张丽

(1.南京医科大学附属脑科医院 老年医学科，江苏 南京 210029； 2.东南大学附属中大医院 高压氧科江苏 南京 210009)

·论 著·

银杏叶片提取物EGB761联合高压氧治疗阿尔茨海默病的疗效分析

朱骏1，张丽达2，董靖德1，卢丽玉1，张利丽1，张丽1

(1.南京医科大学附属脑科医院 老年医学科，江苏 南京 210029； 2.东南大学附属中大医院 高压氧科江苏 南京 210009)

目的：研究应用高压氧(HBO)联合银杏叶片提取物(EGB761)治疗阿尔茨海默病(AD)的临床疗效及机制。方法：纳入2013年12月至2016年6月南京脑科医院初诊断AD患者共120例，按随机数字法将120例患者随机分为对照组、HBO治疗组、EGB761治疗组、HBO联合EGB761治疗组。所有患者治疗前后进行MMSE、ADL、ADAS- Cog量表评估，并抽血检测TGF- β1、IL- 1β、SOD、MDA、GSH- PX水平。结果：HBO治疗组及EGB761治疗组量表评估较基线时评分均有明显的改善；此外，联合使用HBO及EGB761较单用HBO或EGB761治疗改善更明显；HBO组、EGB761组和HBO+EGB76l组的血清SOD活性、GSH- PX、TGF- β1的含量水平均提高，MDA及IL- 1β水平降低，且HBO联合EGB761治疗组血清中相关因子水平的改变更为显著。结论：HBO联合EGB761对改善AD患者认知能力、日常生活活动能力效果确切，可能与其抑制氧化自由基及炎症因子的过度损伤有关。

阿尔茨海默病； 高压氧； 银杏叶； 认知； 炎症因子

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是引起痴呆的最常见疾病，病变基础为大脑皮质、海马等中枢神经细胞功能退化，临床以高级认知功能下降为主，表现为不同程度记忆力、判断力、定向力等下降，常伴有进行性日常生活能力减退、情感反应障碍和性格改变[1]。近年来临床流行病学的统计结果表明，65岁后每5年的发病率上升两倍，而每年每10万人中就有1 275新发病例。AD的临床特点是隐袭起病，逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。病情呈进行性加重表现，且逐渐丧失独立生活能力，发病后5～10年因并发症而死亡[2]。随着社会人口老龄化，AD患病率逐年升高，给家庭和社会造成沉重负担。目前，AD尚无根治或逆转的治疗方法。本研究应用高压氧(hyperbaricoxygen, HBO)联合银杏叶片提取物(ginkgo biloba extract, EGB761)治疗AD，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2013年12月至2016年6月于南京脑科医院初诊断AD患者共120例，其中男64例，女56例；年龄62～78岁，平均(68.52±3.21)岁；病程4～17个月，平均病程(11.81±5.33)个月；

1.2 诊断标准及排除标准

诊断标准：(1) 根据美国国立神经疾病研究院和脑卒中原老年性痴呆及相关疾病协会(NINDS- ADRDA)标准诊断AD；(2) 经美国精神医学会《精神障碍诊断和统计手册》第Ⅳ版标准诊断为痴呆(DSM- Ⅳ)，Hackinski缺血评分量表<4分者。(3) 所有患者均未使用认知相关药物治疗。排除标准：(1) 排除影响神经功能的内科疾病，如甲亢、酒精中毒性脑病、糖尿病及其他严重的脏器疾病。(2) 排除有严重的精神类疾病(如精神分裂症、抑郁症等)、严重脑卒中史和严重头部外伤者。(3) 伴有严重内科疾病影响智能者、无可靠陪护不能监控患者服用药物者、患者信息提供不可靠者。所有患者均签署知情同意书，愿意接受各种问卷和量表调查。

1.3 研究方法

按随机数字法将入组的120例AD患者分为对照组、HBO治疗组、EGB761治疗组、HBO+EGB761治疗组。对照组患者不给予任何治疗干预，HBO治疗组给予HBO治疗2周，EGB761治疗组给予EGB761治疗2周(剂量：70 mg·d-1)，HBO+EGB761治疗组给予HBO加EGB761共同治疗2周。银杏叶提取物EGB761由德国威玛舒培博士药厂提供，HBO治疗压力为0.23 kPa，每次治疗吸氧80 min，中间休息10 min，HBO治疗每日1次。

1.4 量表评估

所有患者在治疗前、治疗结束时均采用简易精神状态检查法(mini- mental stste examination, MMSE)[3]检测患者的认知功能，MMSE量表中满分为30分。日常生活能力评定量表(activities of daily living scale, ADL)(20项版)[4]用于评定患者日常生活能力，ADL量表共20项,每项按照自己完全可以做、可以做但有些困难、有较大困难需要人帮助、完全需要人帮助分别记为1、2、3、4分。AD评定量表—认知部分(Alzheimer disease assessment scale- cognitive subscale, ADAS- Cog)量表评估[5]，ADAS- Cog能够评估患者的认知功能，包括记忆、注意、语言、定向、视空间、理解以及操作能力等12个项目，可以有效评估患者认知功能障碍的严重程度，得分越低说明认知功能越好。

1.5 血样采集

完成知情同意后采集，整个采血过程由医院护士完成，并严格按照釆血操作规范进行:过夜禁食12 h后晨起空腹抽取静脉血5 ml于生化管中，2 000 r·min-1离心15 min，分离血清，保存于-80 ℃冰箱,以备指标的检测。服药前1 d及治疗结束时分别抽取。

1.6 血清中TGF- β1、IL- 1β的测定

按照TGF- β1和IL- 1β ELISA试剂盒说明书检测患者外周血的TGF- β1和IL- 1β的表达水平，并用酶标仪读取吸光度数值，根据标准品制作标准曲线，从标准曲线中求出各样本TGF- β1和IL- 1β的水平。

1.7 血清过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH- PX)测定

SOD、GSH- PX、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，血清SOD、GSH- PX活性及MDA含量分别采用黄嘌呤氧化酶法、比色法及硫代巴比妥酸法进行检测。检测方法严格按照试剂盒说明书进行，并严格按照仪器操作规程进行操作。

1.8 安全性的评估方法

采用不良反应量表(TESS)评判4组治疗的安全性，在干预前后各进行1次评判。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 一般资料统计结果

4组患者在年龄、性别组成、病程及教育程度评分方面差异均无统计学意义，此外4组患者高血压、冠心病及糖尿病的发生率差异亦无统计学意义。见表1。

2.2 治疗的不良反应

对照组发生不良反应为8例，其中全身乏力2例、失眠2例、恶心2例、头晕2例、皮疹0例；HBO组发生不良反应为10例，其中全身乏力3例、失眠2例、恶心2例、头晕2例、皮疹1例；EGB761组发生不良反应为9例，其中全身乏力2例、失眠1例、恶心3例、头晕2例、皮疹1例；HBO+EGB761组发生不良反应为11例，其中全身乏力3例、失眠2例、恶心2例、头晕3例、皮疹1例。所有出现的不良反应给予对症处理后好转。治疗组不良反应发生率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 4组患者间一般资料的比较

组 别年龄/岁病程/月高血压史/例糖尿病史/例冠心病史/例男∶女/例教育程度a/例对照组68．5±3．211．3±4．4128416∶1411/13/6HBO组67．3±4．112．1±5．3117617∶1312/11/7EGB761组66．6±4．111．9±4．6135515∶1512/12/6HBO+EGB761组67．5±4．611．5±4．9106416∶1413/10/7F/χ2值3．2152．9542．5141．7791．6251．6592．755P值0．290．450．6410．6780．7520．7990．365

a 教育程度：小学及以下/中学/大学及以上

表2 不同组别之间不良反应的比较 例

注：括号中为所占百分比

2.3 不同组别患者量表评估结果

基线时4组患者MMSE、ADL及ADAS- Cog量表评分差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后HBO组及EGB761治疗组量表评估较基线时评分均有明显改善，此外联合使用HBO+EGB761较单用HBO或EGB761治疗改善更明显，详见表3。

表3 不同组别之间量表评估的结果比较 分

a 治疗前后比较，P<0.05; b HBO组vs对照组，P<0.05; c HBO组vsEGB761组，P<0.05;d EGB761组vs对照组，P<0.05;e HBO组vsHBO+EGB761组，P<0.05;f EGB761组vsHBO+EGB761组，P<0.05;g HBO+EGB761组vs对照组,P<0.05

2.4 血清自由基及相关炎症因子的测定

基线时4组患者TGF- β1、IL- 1β、SOD、MDA、GSH- PX水平无显著差异(P>0.05)；治疗后与对照组相比较，HBO组、EGB761组和HBO+EGB761组的血清SOD活性、GSH- PX水平、抗炎因子TGF- β1的含量水平均提高(P<0.05)，MDA及IL- 1β水平降低(P<0.05)；而HBO+EGB761组血清中的这些因子水平的变化较单用HBO组或EGB761组更为显著(P<0.05)。详见表4。

表4 不同组别之间血清中相关因子的比较

组 别SOD/nU·ml-1MDA/nmol·ml-1GSH⁃PX(酶活力单位)IL⁃1β/pg·ml-1TGF⁃β1/ng·ml-1治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后对照组73．1±10．278．6±11．47．3±0．86．9±0．7173．5±37．4176．2±35．4131．4±18．3125．7±14．621．7±8．422．3±7．5HBO组75．8±11．497．8±17．8abc6．4±0．74．0±0．6abc168．6±27．4183．4±33．2abc123．4±16．2108．6±13．3abc19．8±6．325．8±6．2abcEGB761组77．6±12．393．4±16．3ad6．9±0．64．2±0．7ad169．2±30．2186．3±32．5ad126．9±17．1112．7±13．2ad23．5±7．328．1±8．2adHBO+EGB761组79．3±9．5121．3±22．7aefg7．4±0．93．1±0．8aefg170．9±29．5197．2±42．3aefg128．4±15．3109．7±12．9aefg22．9±6．831．3±8．0aefg

a 治疗前后比较，P<0.05; b HBO组vs对照组，P<0.05; c HBO组vsEGB761组，P<0.05;d EGB761组vs对照组，P<0.05;e HBO组vsHBO+EGB761组，P<0.05;f EGB761组vsHBO+EGB761组，P<0.05;g HBO+EGB761组vs对照组，P<0.05

3 讨 论

AD患者认知水平呈进行性衰退，目前发病机制尚未完全明确，由于其病因复杂，发病机制涉及面广泛，给临床治疗带来了巨大困难。AD发病机制可能与中枢神经系统乙酰胆碱水平降低有关。病因学说有10多种，如胆碱能学说、Aβ级联学说、氧化应激学说、神经细胞凋亡学说、谷氨酸能假说、免疫与炎症学说、基因遗传学说、有毒金属离子学说、钙代谢紊乱学说以及雌激素缺陷等[6]。缺血、缺氧等因素加速了这些病人的神经元变性与死亡，使异常淀粉样蛋白沉淀，产生痴呆等相关的症状。

HBO作为改善脑组织功能的一种重要手段受到越来越多的重视，在临床上已广泛应用。HBO可以增加机体氧含量，从而能够有效提高脑组织氧分压和微循环血流动力，改善缺氧缺血脑细胞的状态和血液供应障碍，促进脑组织的功能提高和正常代谢[7]。

既往的研究表明，HBO除能够引起体内的氧化应激外还能够引起体内的抗氧化酶系统的激活。SOD是体内主要的自由基，能够保护组织免受过氧化和自由基的损伤，常作为机体自由基清除的指标之一。GSH- PX可以清除由活性氧和- OH诱发的脂质过氧化物，从而保护细胞膜结构和功能的完整性。MDA是机体脂质过氧化的毒性产物，其含量间接反映出组织细胞损伤程度。Ozden等[8- 9]发现HBO能够显著提高抗氧化酶GSH和SOD的活性，同时降低MDA产物的水平。本研究则首次在采用HBO治疗AD患者中有了同样的发现；此外，无论是单纯采用HBO或者EGB761治疗，均可以明显改善患者的认知水平及日常生活能力；TGF- β1是一种常见的抗炎因子，通过稳定细胞内钙离子浓度拮抗兴奋性氨基酸神经毒性和抗氧化抑制细胞凋亡[10]。本研究结果显示，应用HBO可以提高痴呆患者TGF- β1水平并且降低IL- 1β炎症因子水平，因此可能有利于痴呆病人的脑保护。

银杏叶提取物是从干的银杏叶子中提取的，其提取物已被标准化，简称为“EGB761”，其包含有24%黄酮苷、6%的萜烯内酯(3.1%银杏内酯和2.9%白果内酯)以及大量的原花青素和有机酸等。EGB761治疗对于慢性疾病如神经变性疾病、心血管疾病及癌症等治疗的基本原理研究主要集中在它的抗氧化特点上，其抗氧化作用主要是通过直接清除自由基以及间接抑制自由基的形成发挥的。EGB761能够清除活性氧簇(ROS)，比如羟基(OH-)、过氧化氢基团(ROO-)、超氧阴离子基团(O2-)、一氧化氮簇(NO-)以及过氧化氢(H2O2)[11- 12]。近年来随着对EGb761治疗AD的分子机制的研究逐渐深入，阐明了其影响Aβ的前体蛋白代谢和Aβ聚集、抗谷氨酸毒性、抑制细胞凋亡等作用有关。既往的研究表明，EGB761可提高大鼠的学习和记忆能力并明显减少老年斑沉积和神经原纤维缠结形成[13]。Mazza等在一项随机、对照、双盲的6个月临床研究中发现，EGb761与第2代胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐在治疗轻、中度AD时疗效相当[14]。本研究中使用EGB761的患者可以改善患者认知水平及日常生活能力，并且可以提高抗氧化酶GSH和SOD的活性，降低MDA产物的水平，同时提高痴呆患者TGF- β1水平及降低IL- 1β炎症因子水平，提示EGB761通过抑制氧化自由基及炎症因子对神经元的损伤作用，从而保护患者神经功能，继而改善患者认知水平。

目前尚无HBO联合EGB761治疗AD的临床研究报道。既往的动物研究表明，HBO+EGB761能够显著提高拟AD模型大鼠血清及海马组织的SOD、GSH活性，降低MDA的含量,并且HBO+EGB761组的SOD、GSH活性提高、MDA水平的降低较单用HBO或EGB761组为显著，提示HBO联合EGB761能发挥更好的保护效应[15]。本研究结果表明，HBO联合EGB761较单纯利用HBO或EGB761更能改善患者的认知及日常生活能力，并且可发挥更强的抗氧化及抗炎作用。提示HBO联合EGB761可以更好地发挥脑保护作用。

上述研究和观察表明，HBO联合EGB761对改善AD患者认知能力、日常生活活动能力效果确切，可能与其抑制氧化自由基及炎症因子的过度损伤有关，具体的机制值得继续研究和探讨。

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(本文编辑：周兰波)

The possible protective mechanisms of hyperbaric oxygen and ginkgo biloba extract on Alzheimer’s disease

ZHU Jun1，ZHANG Li- da2,DONG Jing- de1，LU Li- yu1，ZHANG Li- li1，ZHANG Li1

(1.DepartmentofGeriatricMedicine，NanjingBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China; 2.DepartmentofHyperbaricOxygen,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective:To explore the treatment effect and the possible protective mechanism of hyperbaric oxygen(HBO) and the ginkgo biloba extract(EGB761) in Alzheimer disease(AD). Methods: One hundred and twenty patients were randomly divided into 4 groups including control group, HBO group, EGB761 group and HBO+EGB761 group. All patients were estimated by MMSE,ADL and ADAS- Cog. The levels of TGF- β1, IL- 1β, SOD, MDA and GSH- PX were detected before and after treatment. Results: In our research, the scale assessment had been improved in the treatment of HBO and EGB761, and the combination showed the better. The activities of SOD, GSH- PX and TGF- β1were increased in HBO, EGB761 and HBO + EGB76l group, compared with the control group, and the levels of MDA and IL- 1β were reduced(P<0.05). Further, the combination of HBO and EGB761 showed the better compared with the HBO group and EGB761 group, respectively. Conclusion: The ability of cognition and daily life in AD patients can be improved by combination of HBO and EGB761 in our study, which may be association with the inhibition of oxygen free radical and inflammatory factors by HBO and EGB761 inducing the excessive damage.

Alzheimer disease; hyperbaric oxygen; ginkgo biloba; cognition; inflammatory factors

2016- 11- 03

2016- 12- 18

南京市医学科技发展重点项目(ZKX13034)

朱骏(1990-)，男，安徽马鞍山人，住院医师，医学硕士。E- mail:1009065726@qq.com

张丽 E- mail:neuro_zhangli@163.com

朱骏,张丽达,董靖德,等.银杏叶片提取物EGB761联合高压氧治疗阿尔茨海默病的疗效分析[J].东南大学学报:医学版,2017,36(2):235- 240.

R749.16

A

1671- 6264(2017)02- 0235- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.021