缺血性心肌病患者血浆miR- 21和miR- 214的表达及其意义

余信强，张苏川，刘敏，蒋伟

{江汉大学附属医院(武汉市第六医院) 心血管内科，湖北 武汉 430016}

·论 著·

缺血性心肌病患者血浆miR- 21和miR- 214的表达及其意义

余信强，张苏川，刘敏，蒋伟

{江汉大学附属医院(武汉市第六医院) 心血管内科，湖北 武汉 430016}

目的：探讨缺血性心肌病(ICM)患者血浆miR- 21和miR- 214的表达及其意义。方法：选取2015年1月至2016年1月我院收治的ICM患者和同期体检健康的志愿者各33例，检测血浆miR- 21和miR- 214表达水平、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL- C)、低密度脂蛋白(LDL- C)、舒张压(DBP)、收缩压(SBP)、N末端B型脑钠肽原(NT- proBNP)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)、左心室射血分数(LVEF)。分析ICM患者miR- 21及miR- 214水平与各指标的相关性，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价其对ICM的诊断价值。结果：ICM组与对照组TC、TG、DBP及SBP比较差异无统计学意义(P>0.05)；ICM组HDL- C、LVEF低于对照组，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV高于对照组(P<0.05)；ICM组miR- 21及miR- 214表达水平较对照组显著上调(P<0.001)。ICM患者miR- 21及miR- 214水平与NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈正相关(P<0.05)，与LVEF呈负相关(P<0.05)。二者联合诊断的ROC曲线下面积(AUC，为0.865)、灵敏度(87.5%)和特异度(78.3%)均大于单独诊断(P<0.05)。结论：ICM患者血浆miR- 21和miR- 214表达升高，且与NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV呈正相关，与LVEF呈负相关，可能参与了ICM患者心室重构过程。联合检测对ICM有较好的诊断效能，或可作为临床上鉴别诊断ICM的生物标志物。

缺血性心肌病； 微小RNA； 心室重构

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy， ICM)是冠心病的一种特殊类型或晚期阶段，是指由于冠状动脉管腔狭窄或堵塞引起的长期心肌缺血。心室重构是导致ICM最终进展为心力衰竭的重要病理生理机制，这一过程伴随着心肌细胞缺血引起的心肌代偿性肥大、肥厚，继而进展为失代偿，心肌细胞萎缩甚至凋亡[1]。miRNAs是近几年来被大量研究的一类非编码单链小分子RNA，它通过调节基因表达、蛋白质翻译及其靶RNA的稳定性而发挥生物学作用[2]。有研究报道显示，miR- 21[3- 5]和miR- 214[6- 7]在多种心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用。本研究旨在探讨ICM患者血浆miR- 21和miR- 214的表达，并揭示其在ICM患者心室重构中的意义，从而为临床上ICM的鉴别诊断提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2016年1月在我院就诊的经确诊为ICM的患者33例为ICM组，另选取我院同期体检的33例健康志愿者为对照组。依据2010年美国心脏病学会诊断标准：(1)冠脉造影显示至少有1条冠脉及分支病变性狭窄≥50%；(2)左心室扩大，左心室射血分数(LVEF)≤40%；(3)心脏功能分级Ⅲ级及以上。排除标准：(1)风湿性心肌病、原发性心肌病等其他类型心脏疾病引起的心脏扩大；(2)伴乳头肌功能不全、室间隔穿孔等严重冠心病并发症；(3)伴肿瘤、肝肾功能严重不全、急性传染病、自身免疫性疾病等其他系统严重疾病；(4)伴脑出血、脑梗死等其他心脑血管疾病。两组对象性别、年龄、病程、吸烟史、糖尿病史等一般临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均签署知情同意书，并经本院医学伦理委员会批准。

1.2 主要仪器和试剂

EPIQ7心脏彩超机(美国PHILIPS)，Nano Drop 2000c分光光度计(美国Thermo Scientific)，C1000荧光定量PCR仪(美国BIO- RAD)，COBAS INTEGRA 800全自动生化分析仪(瑞士Roche)，miRNeasy Serum/Plasma Kit提取试剂盒(德国QIAGEN)，逆转录试剂盒(法国Fermentas)，miR- 21、miR- 214及U6引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.3 常规指标检测

采集对象清晨空腹肘静脉血，2 h内送检，测定总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein，HDL- C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL- C)、N末端B型脑钠肽原(NT- proBNP)。心脏彩超检查左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDd)、左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume，LVESV)、LVEF等指标。

1.4 实时荧光定量PCR检测1.4.1 血浆RNA提取 采集对象抗凝全血，按提取试剂盒步骤提取，采用Nano Drop 2000c评估质量，样品A260/A280值为2.0，提示所提取RNA满足实验要求。

1.4.2 miRNA逆转录成cDNA 按逆转录试剂盒步骤操作，反应体系：5×miScript HiSpec Buffer 2 μl，10×miScript Nucleics Mix 1 μl，miScript Reverse Transcriptase 1 μl，RNase- free Water 3 μl，模板RNA 3 μl。反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反应结束后冰浴冷却，-20 ℃保存。

1.4.3 实时荧光定量PCR反应 以cDNA为模板建立10 μl反应体系：2×SYBR Green PCR Mix 5 μl，10×miScript Universal Primer(通用下游引物)1 μl，特异性上游引物1 μl，RNase- free Water 2 μl，模板RNA 1 μl。反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,共40个循环。由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，miR- 21上游引物为5′- TAGCTTATCAGACTGATGTTGA- 3′，miR- 214上游引物为5′- ACAGCAGGCACAGACAGGCAGT- 3′，U6引物为5′- ATTCGTGAAG CGTTCCATATTT- 3′。

以U6作内参，结果采用相对定量(2-ΔΔCt)方法进行分析。每个样本3个重复孔，Ct值均值作为样本实际Ct值，减去同一样本U6的Ct值均值，得到相对表达量ΔCT值。ICM组ΔCt值减去对照组ΔCt值得到ΔΔCT值，最后求得2-ΔΔCt值。

地音监测中有各种异常信息，其中最重要的2个指标表现为地音现象的突然加剧或突然沉寂，这两个异常往往与能量的不稳定性释放密切相关，预示的危险性的显著变化。地音异常系数这一指标可以衡量地音活动性的异常程度，包括频次异常系数ka和能量系数ke，其计算公式为

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 两组血脂、血压和心室重构等指标比较

比较两组血脂、血压和心室重构等临床指标，结果显示，两组TC、TG、DBP及SBP比较差异无统计学意义(P>0.05)；ICM组HDL- C、LVEF低于对照组，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

相关指标ICM组(n=33)对照组(n=33)t值P值TC/mmol·L-14．32±1．214．54±1．250．7260．470TG/mmol·L-11．46±0．791．57±0．830．5510．583HDL⁃C/mmol·L-10．91±0．221．04±0．232．346<0．05LDL⁃C/mmol·L-13．05±0．932．59±0．812．143<0．05DBP/mmHg77．5±6．376．1±6．10．9170．363SBP/mmHg125．7±8．3123．3±8．41．1680．247NT⁃proBNP/pg·ml-1608．1±61．4197．3±23．535．90<0．05LVEDd/mm57．3±6．544．9±6．17．99<0．05LVEDV/ml123．3±33．184．1±16．46．10<0．05LVESV/ml55．7±8．733．8±6．311．71<0．05LVEF/%45．4±7．261．7±8．58．41<0．05

2.2 实时荧光定量PCR结果分析

目标miRNAs均需制作标准曲线，扩增效率在90%～110%之间，以保证目标miRNAs进行实时荧光定量PCR时表达结果的稳定可靠，见图1。miR- 21和miR- 214均成功扩增出产物，溶解峰均为单峰，Tm介于74.5～76.5 ℃之间，产物具有良好的特异性，见图2。

A图中浓度从左到右依次为1×109、1×107、1×105、1×103、1×101copies·μl-1

图1 miR- 21标准曲线图(E=107.5%，r2=0.999,Slope=-3 453)

A.miR- 21溶解曲线；B.miR- 214溶解曲线

图2 miR- 21和miR- 214的溶解曲线

2.3 两组血浆miRNAs表达水平比较

ICM组血浆miR- 21表达水平较对照组显著上调，差异有统计学意义(t=6.715，P<0.001)。ICM组血浆miR- 214表达水平较对照组显著上调，差异有统计学意义(t=6.514，P<0.001)。见表2和图3。

表达量计算miR⁃21miR⁃214ICM组ΔCt2．153±1．0382．374±1．025对照组ΔCt0．832±0．4311．093±0．475-ΔΔCt1．029±0．3831．206±0．4122-ΔΔCt2．01±0．952．31±1．32t值6．7516．514P值<0．001<0．001

注：表中t值和P值为ICM组ΔCt和对照组ΔCt比较

图3 两组血浆miR- 21和miR- 214相对表达水平比较

2.4 miRNAs表达水平与临床指标的相关性分析

将存在显著性差异的临床指标进行Pearson相关性分析，结果表明ICM患者血浆miR- 21及miR- 214表达水平与NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈明显正相关性(P<0.05)，与LVEF呈明显负相关性(P<0.05)，而与HDL- C及LDL- C无直线相关性(P>0.05)。见表3。

表3 miR- 21和miR- 214的表达水平与临床指标相关性分析

相关指标miR⁃21miR⁃214r值P值r值P值HDL⁃C-0．0890．414-0．1130．337LDL⁃C0．1350．3120．1470．283NT⁃proBNP0．221<0．050．233<0．05LVEDd0．225<0．050．241<0．05LVEDV0．167<0．050．174<0．05LVESV0．213<0．050．285<0．05LVEF-0．241<0．05-0．253<0．05

2.5 miRNAs对ICM的诊断价值

采用ROC曲线评估miR- 21、miR- 214以及二者联合对ICM的诊断价值。二者联合诊断的ROC曲线下面积(AUC为0.865)、灵敏度(87.5%)和特异度(78.3%)均大于miR- 21和miR- 214单独诊断，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4和图4。

表4 miRNAs对ICM的诊断价值

指 标AUC95%CI灵敏度/%特异度/%miR⁃210．7930．706～0．80177．464．3miR⁃2140．7210．653～0．73879．565．8miR⁃(21+214)0．8650．779～0．87387．578．3

图4 miR- 21和miR- 214诊断ICM的ROC曲线

3 讨 论

自首个miRNA于1993年被发现以来，之后在动物和人类中相继发现了大量的miRNAs。miRNAs的发现被视为表观遗传学调控领域的重大突破。有证据表明，疾病引起的miRNAs改变可稳定、特异地反映在血清或血浆中，这一特性使得miRNAs可作为疾病诊断和预后判断的生物标志物[8- 9]。研究显示，miRNAs在心血管系统中高表达，几乎参与了所有的病理生理过程，与心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、心肌细胞凋亡及心肌纤维化等心室重构过程紧密相关[10- 11]。

心肌缺血后，心肌代偿性肥厚、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等心室重构过程是ICM最终进展为心力衰竭的主要病理基础。早期病理性心肌肥厚是一种机体代偿性反应，能够维持心输出量和平衡室壁压力，是心肌面对压力负荷和损伤的适应性扩张，是诸如冠心病、心律失常、高血压等诸多心血管疾病的共同病理生理过程[12]。心肌缺血再灌注可因氧化应激、钙超载等引起心肌细胞坏死或凋亡，坏死的心肌纤维化、心肌间质纤维化致使心室进行性扩张、变形，收缩和舒张功能降低，最后进展为心力衰竭，所以ICM患者防止心室重构尤其重要[13]。

心肌缺血后相关基因及其相应受调节蛋白表达改变，是引起患者心室重构的病理基础。故而，从基因或分子水平切断心室病理性重构过程有可能为临床预防和治疗ICM后心室重构提供新的思路。近年来，与心室重构相关的诸多信号传导通路被一一发现，然而尚无法完全解释心室重构的调控机制。心室重构的发病机制包括了基因表达的再程序化过程，该过程类似于胎儿/新生儿心脏基因表达的再程序化过程。研究发现这个过程伴有多个心脏特异性miRNAs的表达改变，提示miRNAs在心室重构过程中扮演了重要角色。已有的研究显示，多种miRNAs，诸如miR- 126、miR- 508- 5p、miR- 141等等与ICM的病理生理过程有关[14- 15]。

人miR- 21基因在心血管系统高度表达，与心室重构过程中心肌细胞凋亡和心肌纤维化的发生相关。Qin等[3- 4]的研究发现，miR- 21可减少心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡，减少心室重构进程。Thum等[5]的研究发现，miR- 21在心力衰竭患者中的表达显著上调，抑制miR- 21的表达可促进心肌成纤维细胞凋亡而减轻心肌纤维化。miR- 214对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，Aurora等[6]通过对小鼠缺血再灌注的研究发现，敲除miR- 214基因的小鼠心肌细胞凋亡增加及心肌纤维化严重，并且钙离子/钠离子交换通道1(Ncx1)表达增加，引起心肌细胞钙超载，推测miR- 214对心肌缺血再灌注损伤的保护机制可能是通过抑制Ncx1及其下游钙离子信号通路调节心肌细胞钙离子平衡，减轻心肌缺血再灌注损伤时的钙超载。Rooij等[7]的研究发现，扩张性心肌病心力衰竭患者血浆miR- 214表达是正常心脏的1.6倍。本研究结果发现，ICM患者HDL- C、LVEF低于对照组，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV和LVESV高于对照组，提示ICM患者可能存在血脂异常和心室重构的情况。PCR检测发现ICM患者血浆miR- 21及miR- 214表达水平较对照组显著上调。Pearson相关性分析显示，ICM患者血浆miR- 21及miR- 214表达水平与NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈正相关，而与LVEF呈负相关，提示二者很可能参与了ICM患者的心室重构过程。对ICM患者血浆miRNAs表达谱变化的研究颇多，但有关miRNAs作为ICM诊断及风险评估指标的研究却鲜有报道。为此，本研究最后通过采用ROC曲线评估了miR- 21和miR- 214在诊断ICM中的应用价值，结果发现，二者联合检测对ICM有较好的诊断效能，或可作为临床上鉴别诊断ICM的生物标志物。

综上所述，本研究发现ICM患者血浆miR- 21和miR- 214水平升高，且与NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV呈正相关，与LVEF呈负相关，可能参与了ICM患者心室重构过程，而二者联合检测对ICM有较好的诊断效能，或可作为临床上鉴别诊断ICM的生物标志物。但本研究也存在一定的局限性，如研究病例来源单一、病例数较少等，尚需多中心、大样本、长期的实验验证。

[1] 李新立，周艳丽.缺血性心肌病[J].中国实用内科杂志,2012,18(7):495- 497.

[2] TIJSEN A J,PINTO Y M,CREEMERS E E.Circulating microRNAs as diagnostic biomarkers for cardiovascular diseases[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2012,303(9):1085- 1095.

[3] QIN Y,YU Y,DONG H,et al.MicroRNA 21 inhibits left ventricular remodeling in the early phase of rat model with ischemia- reperfusion injury by suppressing cell apoptosis[J].Int J Med Sci,2012,9(6):413- 423.

[4] BONCI D.MicroRNA- 21 as therapeutic target in cancer and cardiovascular disease[J].Recent Pat Cardiovasc Drug Discov,2010,5(3):156- 161.

[5] THUM T,GROSS C,FIEDLER J,et al.MicroRNA- 21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts[J].Nature,2008,456(7224):980- 984.

[6] AURORA A B,MAHMOUD A I,LUO X,et al.MicroRNA- 214 protects the mouse heart from ischemic injury by controlling Ca2+overload and cell death[J].J Clin Invest,2012,122(4):1222- 1232.

[7] ROOIJ E V,SUTHERLAND L B,LIU N,et al.A signature pattern of stress- responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(48):18255- 18260.

[8] CORTEZ M A,CALIN G A.MicroRNA identification in plasma and serum:a new tool to diagnose and monitor diseases[J].Expert Opin Biol Ther,2009,9(6):703- 711.

[9] KROH E M,PARKIN R K,MITCHELL P S,et al.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription- PCR (qRT- PCR)[J].Methods,2010,50(4):298- 301.

[10] WIDMER R J,LERMAN L O,LERMAN A.MicroRNAs:small molecule,big potential for coronary artery disease[J].Eur Heart J,2016,37(22):1750- 1752.

[11] XU X,LI H.Integrated microRNA gene analysis of coronary artery disease based on miRNA and gene expression profiles[J].Mol Med Rep,2016,13(4):3063- 3073.

[12] 商卓,王文.基质金属蛋白酶与压力超负荷致心室重构的研究进展[J].现代医学,2010,38(3):324- 327.

[13] ZHANG B,SONG C,FENG B,et al.Neuroprotection by triptolide against cerebral ischemia/reperfusion injury through the inhibition of NF- κB/PUMA signal in rats[J].Ther Clin Risk Manag,2016,12(1):817- 824.

[14] QIANG L,HONG L,NINGFU W,et al.Expression of miR- 126 and miR- 508- 5p in endothelial progenitor cells is associated with the prognosis of chronic heart failure patients[J].Int J Cardiol,2013,168(3):2082- 2088.

[15] LIU R R,LI J,GONG J Y,et al.MicroRNA- 141 regulates the expression level of ICAM- 1 on endothelium to decrease myocardial ischemia- reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2015,309(8):1303- 1313.

(本文编辑：周兰波)

Expression of plasma miR- 21 and miR- 214 in patients with ischemic cardiomyopathy and its significance

YU Xin- qiang，ZHANG Su- chuan，LIU Min，JIANG Wei

[DepartmentofCardiovascularInternalMedicine,theAffiliatedHospitalofJianghanUniversity(theSixthHospitalofWuhan)，Wuhan430016,China]

Objective:To investigate the expression of plasma miR- 21 and miR- 214 in patients with ischemic cardiomyopathy (ICM) and its significance. Methods: 33 ICM patients (ICM group) and 33 healthy volunteers (control group) in our hospital from January 2015 to January 2016 were selected. Clinical data of plasma miR- 21 and miR- 214 levels, total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein (HDL- C), low density lipoprotein (LDL- C), diastolic blood pressure (DBP), systolic blood pressure (SBP), N- terminal- pro- B- type natriuretic peptide (NT- proBNP), left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), left ventricular diastolic end diastolic volume (LVEDV), left ventricular end systolic volume (LVESV), left ventricular ejection ejection fraction (LVEF) were collected. The correlation between miR- 21, miR- 214 levels and above indicators were analyzed. The diagnostic value of miR- 21 and miR- 214 on ICM patients were evaluated by receiver operating curve (ROC). Results: There was no significant difference in TC, TG, DBP and SBP between ICM group and control group (P>0.05). The levels of HDL- C, LVEF were lower, while the LDL- C, NT- proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV were higher in ICM group than those in control group (P<0.05). The expression levels of miRNA- 21 and miRNA- 214 in ICM group were significantly higher than those in control group (P<0.001). miR- 21 and miR- 214 levels in ICM patients were positively correlated with NT- proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV (P<0.05), and were negatively correlated with LVEF (P<0.05). The AUC (0.865), sensitivity (87.5%) and specificity (78.3%) of combined diagnosis were higher than separate diagnosis (P<0.05). Conclusion: The levels of plasma miR- 21 and miR- 214 significantly increase in ICM patients. Plasma miR- 21 and miR- 214 are positively correlated with NT proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV, and negatively correlated with LVEF, which may be involved in the process of ventricular remodeling in ICM patients. Combined diagnosis has better diagnostic performance, they may be used as biomarkers for ICM diagnosis.

ischemic cardiomyopathy; miRNAs; ventricular remodeling

2016- 07- 24

2016- 12- 19

武汉市卫生局医学科研计划项目{武卫(2010)42号}

余信强(1977-),男,湖北武汉人,副主任医师。E- mail:jkki384@126.com

蒋伟(1981-) E- mail:hhsskux123@126.com

余信强,张苏川,刘敏,等.缺血性心肌病患者血浆miR- 21和miR- 214的表达及其意义[J].东南大学学报:医学版,2017,36(2):136- 141.

R542.2

A

1671- 6264(2017)02- 0136- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.002