结缔组织生长因子CT结构域的原核表达及分离纯化

薛秀蕾，范小波，吴国球

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009； 2. 东南大学附属中大医院，江苏 南京 210009)

·论 著·

结缔组织生长因子CT结构域的原核表达及分离纯化

薛秀蕾1，范小波1，吴国球2

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009； 2. 东南大学附属中大医院，江苏 南京 210009)

目的：构建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表达载体，实现重组CTGF- CT的可溶性表达及分离纯化，以用于制备CTGF- CT抗体。方法：基因合成CTGF- CT序列，利用NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切后插入pET32a载体，构建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒，阳性质粒转化E.colistrain BL21(DE3)细胞，通过异丙基β- D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组融合蛋白，利用镍柱亲和纯化及肠激酶酶切纯化获得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE鉴定蛋白纯度并进行Western blotting分析。结果：所构建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒验证正确。经诱导表达获得了与预期分子量(28 kD)一致的融合蛋白，融合蛋白经肠激酶切割及两次镍柱亲和纯化获得目的蛋白CTGF- CT，纯化后纯度约95%，Western blotting分析表明纯化目的蛋白为CTGF- CT。结论：通过构建原核pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表达载体实现了重组CTGF- CT蛋白的表达及分离纯化，为CTGF- CT抗体的制备和CTGF- CT功能的深入研究打下了基础。

结缔组织生长因子； 原核表达； 蛋白纯化

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是高度保守的即刻早期基因(CCN)多肽家族成员之一，在细胞增殖、合成胶原、介导细胞黏附和趋化、诱导细胞凋亡、促进血管和肉芽组织形成等多方面均发挥着重要作用[1]。CTGF蛋白有4个功能结构域[2]，依次为胰岛素样生长因子结合蛋白区(IGFBP)、VWF(von willebrand factor)因子的C型重复区(VWC)、血小板反应蛋白I型(TSP- 1)重复区和富含半胱氨酸的C末端(CT区)。其中，CT结构域和受体结合相关[2]。越来越多的研究表明，CT结构域在诱导细胞黏附[3]、调节转录[4]、信号通路激活[5- 6]等方面发挥重要的生物学作用。

本研究目的主要是利用基因工程技术构建CTGF- CT原核表达载体表达纯化融合蛋白，并经过镍亲和层析纯化融合蛋白、肠激酶酶切回收等步骤制备目的蛋白CTGF- CT，经SDS- PAGE、ELISA和Western blotting等分析鉴定所制备的重组CTGF- CT蛋白，为CTGF- CT抗体的制备提供良好的抗原，同时为CTGF- CT的功能研究打下基础。

1 实验材料

1.1 载体和菌株

E.colistrain BL21(DE3)菌株购自New England Biolabs公司(Beverly MA,USA)，pET32a质粒载体购自Novagen公司(Madison Wisconsin,USA),pET32a- TrxA- His- CTGF- CT载体由本实验室构建。

1.2 主要试剂

限制性内切酶(NcoI和XhoI等)及T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司；抗- CTGF单克隆抗体购自R&D SYSTEMS；抗鼠HRP- IgG抗体购自Jackson Imm- unoResearch Laboratories；TRYPTONE(胰蛋白胨)、YEAST EXTRACT(酵母提取物)等发酵培养基成分均来源于OXOID公司；异丙基β- D- 硫代半乳糖(IPTG)、肠激酶、氨苄青霉素、质粒快速提取试剂盒和Ni- IDA亲和层析介质来源于南京金斯瑞生物科技有限公司；预染蛋白质标准品来源于Thermo Fisher Scientific；透析袋和超滤管购自Millipore公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究中心；其他试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 CTGF- CT基因的合成及pET32a- CTGF- CT表达载体的构建

利用GenBank检索并下载人CTGF基因序列(ACCESSION:CR541734.1)，根据其中CTGF- CT序列和大肠杆菌密码子偏爱性得到cDNA序列，设计PCR引物并基因合成目的CTGF- CT序列，引物F：GATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAA；引物R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGCCATGTCTCCGTACATCTTC。基因合成产物和pET32a载体用NcoI和XhoI限制内切酶酶切，连接两个片段组成原核表达载体pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。转化大肠杆菌E.colistrain BL21(DE3)，挑选阳性克隆提取质粒并进行测序验证。pET32a- CTGF- CT表达载体构建示意图见图1。

图1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表达载体的构建

2.2 CTGF- CT蛋白的表达及纯化

将pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒转化至E.colistrain BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至5 ml含100 mg·ml-1Amp的LB液体培养基内，37 ℃ 200 r·min-1振荡培养12 h作为种子液，次日按照1 ∶100的比例接种于200 ml含Amp(100 mg·ml-1)的LB液体培养基内，37 ℃ 220 r·min-1培养2～3 h至OD600值为0.6～0.8，取1 ml培养物作为诱导前对照样品；向剩余培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，20 ℃ 160 r·min-1诱导培养8 h，收集菌体。每克湿重的菌体加入5 ml细菌裂解液(100 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O,10 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)进行充分悬浮，冰浴下超声波破碎菌体后4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min，将收集的上清样品用Ni- IDA亲和层柱进行纯化获得融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)，BCA法对可溶表达的融合蛋白进行定量检测。透析后融合蛋白样品加入酶切缓冲液后每1 mg目的蛋白加入2 U肠激酶，4 ℃酶切10 h，利用TrxA- His与CTGF- CT标签的差异性特点再次利用镍柱纯化并分离获得目的蛋白(CTGF- CT)，BCA法进行定量，收集目的蛋白冷冻干燥后保存。上述原核表达及纯化过程中得到的样品均进行SDS- PAGE分析。

2.3 重组蛋白CTGF- CT的分析

CTGF- CT目的蛋白的Western blotting检测：根据目的蛋白分子量，采用10%分离胶和5%浓缩胶进行SDS- PAGE凝胶电泳，冰浴下恒流200 mA，电转移1 h；封闭后加入抗CTGF单克隆抗体(1∶1 500)，置振荡器孵育，4 ℃过夜后PBST漂洗滤膜4次；将PVDF膜置于羊抗鼠HRP-IgG抗体(1∶1 500)溶液中，室温下摇荡标记1.5h后PBST漂洗滤膜5次；ECL显色观察结果。

3 实验结果

3.1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒的鉴定

利用NcoI和XhoI限制性内切酶对引物F、引物R所合成基因产物和pET32a载体同时进行双酶切，连接回收后片段构建成重组表达载体pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。将阳性转化克隆中所提取质粒利用NcoI和XhoI双酶切，结果在图2中可见大小分别为5 kb和400 bp左右的条带，其中400 bp左右的条带为特征性片段。同时，DNA测序证实CTGF- CT阅读框正确无误，表明pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒表达载体构建成功。

M.DNA分子量标准; 1. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT质粒; 2. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT质粒双酶切

图2 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表达载体的酶切鉴定

3.2 CTGF- CT蛋白的表达及纯化

将IPTG(0.5 mmol·L-1)诱导表达1、2、4、6、8 h后的菌体裂解后超声破碎，离心后所获上清和沉淀分别进行SDS- PAGE分析，结果显示在28 kD左右有目标重组蛋白表达且与融合蛋白理论分子量相符，重组融合蛋白的表达大部分以可溶性形式存在于上清(图3)。利用BCA法测得融合蛋白在3次洗脱液中的浓度分别为2.63、1.36和1.13 mg·ml-1，3次洗脱液体积分别为500、400和300 μl，计算得出1 L菌液共收获6.20 mg可溶融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)。

重组表达载体pET32a- TrxA- His- CTGF- CT的构建是在pET32a(+)载体上利用NcoI和XhoI酶切位点插入目的蛋白CTGF- CT基因，使其以TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白的形式表达。利用His- Tag与Ni- IDA亲和层析介质的结合进行融合蛋白的纯化简便有效，融合蛋白进行Western blotting分析(图4 Lane 2)。经肠激酶酶切后融合蛋白被酶切为TrxA- His和CTGF- CT，酶切反应液利用固定金属亲和层析(IMAC)进一步纯化，从凝胶层析流出液中收集目的CTGF- CT蛋白(图5 Lane 2)，BCA法蛋白定量检测计算得出1 L菌液共收获2.31 mg目的蛋白CTGF- CT。

M.蛋白标准品; 1.未加诱导剂菌体对照; 2～6.诱导1、2、4、6和8 h菌体超声后上清

图3 重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的SDS- PAGE分析

M.蛋白标准品; 1.纯化的CTGF- CT; 2.纯化的融合蛋白

图4 融合蛋白及目的蛋白纯化后Western blotting分析

3.3 重组蛋白CTGF- CT的分析

利用直接ELISA检测纯化所得CTGF C端CT区即CTGF- CT的活性(图6)，Western blotting鉴定纯化所获蛋白(图4 Lane 1)。

4 讨 论

CTGF(CCN2)是由349个氨基酸残基组成的分泌性多肽，分子量为36～38 kDa。CTGF可以促进细胞增殖[7- 8]及细胞外基质的形成[2]，在介导细胞黏附[1]、迁移[9]、炎症[10- 11]及促进血管形成中发挥广泛的作用[1- 2]。CTGF的C端即CT区功能结构域在促进细胞黏附[3,12]、激活促炎症因子[6]、调节转录[4]、激活信号通路[5]、直接介导CTGF与整合素受体之间的结合[13]等方面发挥重要作用。因此，本研究关注CTGF的C端结构域即CT区(CTGF- CT)的表达纯化，制备生产足量优质的CTGF- CT重组蛋白，以利于后续相关特异性抗体研究和功能研究。

M.蛋白标准品; 1、6.未加诱导剂对照; 2.肠激酶切割液上镍柱后流出液;3.肠激酶切割液; 4.镍柱纯化的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT; 5.诱导后菌体蛋白; 7.肠激酶切割液上镍柱后洗脱液

图5 融合蛋白及目的蛋白纯化的SDS- PAGE分析

图6 ELISA检测表达蛋白的活性

E.coli系统遗传图谱明确、操作简便易行、生产成本较低，且对许多蛋白质有很强的耐受力，是许多重组蛋白的首选表达系统。在E.coli表达系统中，融合蛋白表达系统可提高目的蛋白的产量、减少蛋白质的错误折叠和包涵体的形成、方便后续分离纯化。本实验选用IPTG诱导启动子表达载体(pET32a)，构建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表达载体，CTGF- CT目的蛋白N端融合硫氧还蛋白(TrxA)并引入组氨酸标签，方便进行重组蛋白CTGF- CT的体外表达及纯化，以期获得可溶表达的重组蛋白。分子伴侣TrxA的引入可以帮助外源蛋白成功表达、降低宿主细胞对外源蛋白的降解从而可以大大提高蛋白表达产量、可溶性[14]及稳定性[15]；利用组氨酸标签与Ni2+相互作用进行亲和层析纯化，简便有效；pET32a带有pBR322的大肠菌素E1(colE1)复制区，赋予宿主菌氨苄青霉素抗性，有利于阳性克隆子的筛选；为方便后续纯化，pET32a载体中XhoI酶切位点后的His- Tag已去除，仅保留Trx- Tag后的His- Tag。本研究所构建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重组质粒转化E.coliBL21(DE3)IPTG诱导表达并纯化得到纯度大于90%的可溶性TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白，在大肠杆菌成功表达。SDS- PAGE结果显示目标蛋白表达位于28 kD处，这与融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的理论分子量一致，且大部分为可溶蛋白表达形式。

本实验中表达的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的N- 末端连接有His标签，利用镍亲和层析柱纯化融合蛋白，结果显示融合蛋白纯度达90%以上；TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白中His- Tag与CTGF- CT间为肠激酶酶切位点，利用肠激酶的识别酶切对融合蛋白进行切割，利用镍亲和层析对酶切反应液再次进行分离纯化即可获得目的蛋白CTGF- CT。从图4 SDS- PAGE结果中Lane 4、Lane 5和Lane 7可以看出融合蛋白被肠激酶识别切割；酶切下的CTGF- CT不含His- Tag，因此在融合蛋白第2次镍亲和层析纯化过程中，可在流穿液中收集即可获得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE分析显示其纯度大于95%。利用上述纯化方法可在1 L菌液中获得毫克级别的重组蛋白。ELISA检测结果显示，融合蛋白与Anti- CTGF具有良好的结合活性；去除TrxA、His等氨基酸后CTGF- CT与Anti- CTGF结合未受影，仍具有良好的结合活性。同时Western blotting分析验证了融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT和目的蛋白CTGF- CT。

因此，我们纯化得到了理想的CTGF- CT蛋白，可用于后续相关研究工作，同时为进一步研究CTGF- CT的功能奠定了基础。

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(本文编辑：周兰波)

Prokaryotic expression and purification of connective tissue growth factor(CT domain) inE.coli

XUE Xiu- lei1,FAN Xiao- bo1,WU Guo- qiu2

(1.MedicalSchoolofSoutheatUniversity,Nanjing210009,China; 2.ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective: To construct the recombinant pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid and to express and purify CT domain of connective tissue growth factor(CTGF) in order to prepare CTGF- CT polyclonal antibody. Methods: The nucleotide sequence encoding CTGF- CT was chemically synthesized and inserted into the pET- 32a(+) vector. The constructed pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid was transformed intoE.colistrain BL21(DE3). And the TrxA- CTGF- CT fusion protein was induced expression by IPTG; Then CTGF- CT was purified by enterokinase cleavage and Ni- NTA purification and was identified by SDS- PAGE and Western blotting. Results: The authenticity of the recombinant pET32a- TrxA- CTGF- CT- His plasmid was verified by DNA sequencing and it was identified containning a 400 bp fragment byNcoI andXhoI double digestion. The molecular weight of TrxA- CTGF- CT was about 28 kD after IPTG induced expression. After enterokinase cleavage and Ni- NTA purification, the CTGF- CT was obtained as expected molecular weight of 14 kD. Western blotting proved that the protein was CTGF- CT. The purity of the recombinant CTGF- CT was about 95%. Conclusion: The construction of pET32a- TrxA- His- CTGF- CT and the expression and purification of CTGF- CT are successfully achieved. That will lay the foundations for preparation of CTGF- CT antibody and the further study on the function of CTGF- CT.

connective tissue growth factor; prokaryotic expression; protein purification

2016- 09- 08

2016- 12- 06

薛秀蕾(1984-)，女，山东聊城人，医学博士。E- mail: xiulei_xue@163.com

吴国球 E- mail: nationball@163.com

薛秀蕾,范小波,吴国球. 结缔组织生长因子CT结构域的原核表达及分离纯化[J].东南大学学报:医学版,2017,36(2):230- 234.

R- 33; R393

A

1671- 6264(2017)02- 0230- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.020