炙甘草汤含药血清对兔离体膀胱平滑肌的作用

海青山 杨榆青 孟卓然 汝晶 金亚菊

摘要：目的观察炙甘草汤含药血清对正常家兔离体膀胱平滑肌运动的影响，探讨其作用机制。方法运[JP]用Powerlab生物信号系统记录家兔離体膀胱平滑肌标本的活动，观察不同浓度组炙甘草汤含药血清对膀胱平滑肌收缩强度、收缩频率和活动力的影响。结果与空白对照组比较，空白血清和炙甘草汤含药血清各浓度组均可以不同程度增加膀胱平滑肌收缩强度（低浓度血清组P<001，空白血清、中浓度和高浓度血清组（P<005），但含药血清组与空白血清组比较无统计学意义。与空白对照组比较，低浓度血清组可增加膀胱平滑肌收缩频率（P<001），与空白血清组比较无统计学意义。低浓度血清组与空白血清组比较，可增加膀胱平滑肌活动力（P<005）。在低浓度血清组基础上应用阻断剂，维拉帕米可以降低膀胱平滑肌收缩强度（P<005），阿托品可以降低膀胱平滑肌收缩频率（P<001），且均可降低膀胱活动力（P<005）。结论炙甘草汤含药血清可以增强膀胱平滑肌活动力，该作用通过钙通道、M受体起作用。

关键词：炙甘草汤；含药血清；膀胱平滑肌

中图分类号：R2855文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）05-0021-05

[WT5HZ][JZ]Effect of Zhigancao Decoction Containing Serum on Rabbits Isolated Vascular Smooth Muscle

[WT5BZ][JZ]HAI Qing-shan， YANG Yu-qing， MENG Zo-ran， RU Jing， JIN Ya-ju

[WT5"BX][JZ]（1. School of Basic Medical Sciences， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan； [JZ]2. School of Acupuncture and Massage Rehabilitation， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan）

[WT5HZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To observe the effect of Zhigancao Decoction containing serum on the movement of bladder smooth muscle in normal rabbits and to explore its mechanism. Methods： The activity of bladder smooth muscle in rabbits was recorded by using Powerlab biological signal system. The effects of different concentrations of Zhigancao Decoction on contraction intensity， the contraction frequency and activity of bladder smooth muscle were observed. Results： Compared with the blank control group， the blank serum group and groups of different concentration of Zhigancao Decoction containing serum could increase the contraction intensity of the bladder smooth muscle （the low concentration serum group， P<0.01， the blank serum， medium concentration and high concentration serum groups， P< 0.05）， but there was no significant difference between the drug serum group and the blank serum group. Compared with the blank control group， the low concentration serum group could increase the contraction frequency of the bladder smooth muscle （P<0.01）. In the low concentration serum group based on the application of blockers， verapamil could reduce the contraction intensity of bladder smooth muscle （P<0.05） and atropine could decrease the contraction frequency of bladder smooth muscle （P<0.01）， and also decrease the activity of bladder （P<0.05）. Conclusion： Zhigancao Decoction containing serum can promote the activity of bladder smooth muscle， which can act through calcium channel and M receptor.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Zhigancao Decoction， drug-containing serum， bladder smooth muscle

炙甘草湯方出自《伤寒论》，主要治疗“脉结代”，又名复脉汤。在临床报道中，多用于治疗心律失常和心血管相关疾病[1-2]。但文献报道显示，炙甘草汤的治疗范围可能不仅限于心血管系统，对气血两虚的多个系统疾病均有作用[3]。笔者的前期研究发现，炙甘草汤含药血清对血管平滑肌和子宫平滑肌均有不同程度的作用，文献显示其作用机制与调节钙离子通道和相应受体有关[4-6]。本实验通过观察炙甘草汤含药血清对离体膀胱平滑肌的作用，探讨炙甘草汤对各系统平滑肌作用机制的共性。

1材料与方法

11试剂与仪器炙甘草汤方（炙甘草、麦冬、火麻仁、人参、阿胶、生地黄、桂枝、生姜、大枣、清酒）、离心机、恒温水浴锅（DZKW-C；北京光明医疗仪器厂）、洛氏（Locke）液（g/L：NaCl 80，KCl 02，MgCl2 01，CaCl2 02，NaHCO3 10，NaH2PO4 005，Glucose 111）、异博定（广东华南药业集团有限公司）、阿托品（浙江医药股份有限公司）、普萘洛尔（东北制药集团沈阳第一制药有限公司）、Powerlab 生物信号采集处理系统（澳大利亚埃德公司）、自动离体组织恒温平滑肌槽（西班牙PANLAB公司）、张力换能器（西班牙PANLAB公司）、哺乳动物手术器材、混合气体（95% O2 + 5% CO2，昆明氧气有限公司）。

12动物清洁级雌性日本大耳白兔24只，未孕，体重2-25 kg，购自昆明医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK（滇）2011-2014。

13方法

131炙甘草汤水煎剂制备炙甘草、麦冬、火麻仁各12 g，人参、阿胶各6 g，生地黄50 g，桂枝、生姜各9 g，大枣15 g[7]。原方比例不变，煎煮时加清酒50 mL，浓缩成含生药450%的浓缩液，于4℃冰箱贮存备用。

132炙甘草汤含药血清和空白血清制备日本大耳白兔14只，随机分为四组：炙甘草汤低剂量组6只；炙甘草汤中剂量组2只；炙甘草汤高剂量组2只；空白对照组2只。灌胃给药：药物组每日给予炙甘草水煎液，每日2次，共3天，剂量分别为：115 g/kg·次、23 g/kg·次、46 g/kg·次。空白组给予等容积的生理盐水。末次灌药前禁食12 h，不禁水，给药后15 h颈部手术，颈动脉采血，分离血清，-20℃保存待用[8]。

133兔离体膀胱平滑肌条标本制备大耳白兔，钝性击昏，迅速剪开腹腔，取出膀胱，立即放于盛有洛氏液的玻璃平皿内，小心清除残留结缔组织，制备成5 mm×2 mm膀胱平滑肌标本条。一端固定于L型通气道小钩上，另一端与换能器相连。

134炙甘草汤含药血清对兔离体膀胱平滑肌影响的离体实验将膀胱平滑肌条标本悬挂于含（375±05）℃洛氏液恒温平滑肌槽中，连接张力换能器，通入95% O2 + 5% CO2的混合气体，给予基础张力2 g，用Powerlab生物信号系统记录收缩波，稳定45 min，每15 min换液一次。待标本平衡后，开始实验。Powerlab生物信号系统记录收缩波，观察标本的收缩强度（g）、收缩频率（次/10 min）和活动力（g·次/10 min）。每次实验后，用37℃洛氏液冲洗3次，使标本张力恢复至基线再进行下一次实验。

膀胱活动力（g·次/10 min）=收缩强度（g）×收缩频率（次/10 min）

14统计学处理采用SPSS140软件对采集到的数据进行分析，计量资料的自身前后对比，采用配对t检验，P<005时有统计学意义。

2结果

21不同浓度炙甘草汤含药血清对兔离体膀胱平滑肌的影响在恒温平滑肌槽中分别加入空白血清和不同浓度炙甘草汤含药血清，观测标本收缩强度、收缩频率、膀胱活动力的变化。结果见表1。

与空白对照组比较，空白血清组和低、中、高浓度炙甘草汤含药血清组均能够明显增强膀胱平滑肌条收缩强度（低浓度血清组P<001；空白血清和中、高浓度血清组P<005）。低浓度含药血清组可增加膀胱平滑肌的收缩频率（P<001）。空白血清组与低、中浓度含药血清组对膀胱活动力具有明显的增强作用（空白血清和低浓度血清组P<001；中浓度血清组P<005）。

与空白血清组比较，炙甘草汤低浓度含药血清组对膀胱平滑肌的收缩强度和频率的影响不明显（P >005），但增强膀胱平滑肌活动力的作用有统计学意义（P<005）。中浓度和高浓度炙甘草汤含药血清对膀胱平滑肌收缩强度、收缩频率和活动力的影响与空白血清组比较不具有统计学意义。

32炙甘草汤低浓度含药血清加阻断剂对兔离体膀胱平滑肌的影响在恒温平滑肌槽中先滴加体积浓度比为10%的低浓度含药血清作为对照，分别加入不同受体阻断剂。结果见表2。

4讨论

41炙甘草汤含药血清对兔膀胱平滑肌收缩强度的作用如图1所示，各浓度炙甘草汤含药血清组均能明显的增加膀胱平滑肌收缩强度。以作用最强的低浓度含药血清组作对照，应用三种不同的受体和通道阻断剂：维拉帕米、阿托品和普萘洛尔，分别阻断钙通道、M受体和β受体，观察膀胱平滑肌收缩强度的变化，仅维拉帕米可降低膀胱平滑肌的收缩强度。说明，炙甘草汤含药血清对膀胱平滑肌的兴奋作用与血清中可兴奋钙通道的生物活性成分有关，与M受体和β受体无关。维拉帕米作为一种钙通道阻滞剂能抑制Ca2+内流，炙甘草汤含药血清有可能通过增加Ca2+内流，进而使Ca2+与肌钙蛋白的结合加强，横桥和细肌丝的结合增加，进而增加膀胱平滑肌收缩强度。这一结果与之前的研究结果相似[6，9]。但空白血清自身含有的生物活性成分也显示出类似的兴奋膀胱平滑肌的作用，提示空白血清中也含有兴奋钙通道的生物活性成分。排除空白血清自身的作用，含药血清对膀胱平滑肌收缩强度的作用不具有统计学意义。说明兴奋钙通道的生物活性成分与炙甘草汤诱导作用尚无确切的相关性。据实验结果，或可通过增加实验例数确定。

42炙甘草汤含药血清对兔膀胱平滑肌收缩频率的作用如图2所示，与空白对照组比较，仅低浓度炙甘草汤含药血清组有明显的增加膀胱平滑肌收缩频率的作用。在低浓度含药血清作用的基础上，分别用维拉帕米、阿托品和普萘洛尔阻断钙通道、M和β受体。结果显示，阿托品则对膀胱平滑肌的收缩频率具有降低的效果，说明炙甘草汤含药血清增加膀胱平滑肌频率的作用与M受体有关。M毒蕈碱型受体广泛的存在与平滑肌中，M受体兴奋时可引起平滑肌收缩频率增加。但排除空白血清自身的作用后，低浓度含药血清组增加膀胱平滑肌收缩频率的作用就不具有统计学意义了。说明血清中含有兴奋M受体的生物活性成分，如乙酰胆碱（Ach）等，可以引起类似的增强膀胱平滑肌收缩频率的作用。炙甘草汤能否诱导血清中Ach或类似Ach的活性成分的增加，尚无确切的依据。

43炙甘草汤含药血清对兔膀胱平滑肌活动力的作用如图3所示，膀胱活动力叠加了收缩强度和收缩频率两个影响因素。低、中浓度炙甘草汤含药血清组均显示出增加膀胱平滑肌活动力的作用。排除空白血清自身作用后，低浓度含药血清依然可增强膀胱平滑肌的活动力。以低浓度含药血清组作对照，维拉帕米和阿托品均能够阻断低浓度炙甘草汤血清的兴奋作用。说明，炙甘草汤低浓度含药血清对膀胱平滑肌的兴奋作用可能通过两条途径有关，一方面兴奋钙通道，增加Ca2+内流，增加膀胱平滑肌收缩强度；另一方面兴奋M受体，增加膀胱平滑肌收缩频率。但其兴奋作用没有浓度依赖性的增加，可能与其双向调节作用有关[1]。说明在剂量增加的情况下诱导机体产生的生物活性物质发生了变化，兴奋作用反而减弱。[KG）]

5结论

低浓度炙甘草汤含药血清组对膀胱平滑肌条具有兴奋作用，随着剂量的增加其兴奋作用反而减弱，这与剂量增加的情况下诱导机体产生的生物活性物质发生变化有关。炙甘草含药血清对增加膀胱平滑肌收缩强度和收缩频率的单一影响不确定，但叠加收缩强度和频率两种因素后，低浓度炙甘草汤含药血清对膀胱的兴奋作用确切。通过添加阻断剂反向证明，炙甘草汤低浓度含药血清对膀胱平滑肌的兴奋作用可能与兴奋钙通道和M受体两条途径有关。该机制可能是炙甘草汤对各系统平滑肌作用的共性基础[4-5]。炙甘草汤兴奋钙通道是通过哪些中间产物[FL）][SD1，1][FQ（11*3/2。175mm，X，DY-W][SQ+1mm][CD=175mm]发挥作用，兴奋M受体的作用是否与Ach相关，其双向调节作用的机制与诱导血清内成分改变的关系等，还有待于进一步实验证明。[KH*1D]

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