市售酸奶中乳酸菌的分离与鉴定

孟晓华

市售酸奶中乳酸菌的分离与鉴定

孟晓华

（鹤壁职业技术学院，河南鹤壁458030）

采用MRS培养基和普通肉汁培养基平板涂布法，分离鹤壁市市售三剑客酸奶和三剑客老酸奶产品中的乳酸菌，并进行革兰氏染色初步鉴定；采用糖发酵试验和生理生化试验对菌种进行鉴定，通过平板菌落计数法计算酸奶中的乳酸菌数和杆球比。结果表明，三剑客老酸奶产品中的乳酸菌数比三剑客酸奶中的乳酸菌数高。

酸奶；乳酸菌；革兰氏染色；糖发酵管

酸奶是以鲜乳（或乳粉）和白砂糖为主要原料，加入经特殊筛选的乳酸菌，在适宜温度下（30～40℃）发酵制成含活性乳酸菌的乳产品。酸奶中含活力强的乳酸菌，能加强肠的蠕动和机体的物质代谢，促进消化吸收，是一种非常有利于人体健康的乳制品。试验利用平板涂布法、革兰氏染色法、糖发酵试验和生理生化试验对市售三剑客酸奶和老酸奶中的乳酸菌进行分离和鉴定，并通过平板菌落计数计算三剑客酸奶及三剑客老酸奶中的乳酸菌数和杆球比，为人们消费提供合理化建议。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

三剑客酸奶和三剑客老酸奶，市售。2种酸奶均采用同一天生产、容量相同的瓶装原味发酵酸奶。

MRS培养基、普通肉汁培养基、糖发酵管等。

酪蛋白胨、牛肉浸取物、酵母提取液、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温80、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、七水硫酸锰、碳酸钙、琼脂、1.6%溴甲酚紫酒精溶液、草酸铵结晶紫溶液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红、香柏油、二甲苯、葡萄糖、白砂糖、乳糖、酒精、氢氧化钠、pH值试纸、生理盐水、蒸馏水。

1.2 仪器设备

BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器、DH3600型恒温培养箱、101-2A型电热鼓风干燥箱、XSP-2C型双筒生物显微镜、SW-CJ-2D型净化工作台、XK97-A型菌落计数器、电子万用炉。

1.3 酸奶中乳酸菌的分离

1.3.1 初筛

（1）培养基的制备。①MRS培养基[1]。酪蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值6.8。②普通肉汁培养基。蛋白胨10g，牛肉浸提物3g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH值7.0。③糖发酵管的制作。牛肉膏5.0g，酵母浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，吐温800.5mL，琼脂1.5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL，蒸馏水1L，按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖、白砂糖、乳糖，分装于试管中121℃高压灭菌15min。

（2）平板涂布分离法。按照无菌操作要求，从市售新鲜三剑客酸奶和三剑客老酸奶中各吸取10mL检样，放入装有90mL无菌水的烧杯内，振摇混匀。将样品充分摇匀后，用10倍稀释法稀释成10-1，10-2，10-3，10-4各种稀释度的样品液。梯度稀释样液后，将稀释液分别进行平板涂布分离。将MRS培养基平板置于厌氧条件下37℃培养48h；普通肉汁培养基放在需氧条件下37℃培养48h；隔一段时间观察1次。菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌[2]，挑取单菌落，做革兰氏染色、镜检。

（3）酸奶中乳酸菌镜检涂片的特殊染色法。取1块干净载玻片，滴上1滴生理盐水，用接种环挑取少量单菌落于载玻片上，涂成薄薄的涂面，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定。在载玻片上滴加适量草酸铵结晶紫染色液（美蓝染液）染色约1min，用水小心冲洗后滴加卢哥氏碘液媒染1min，洗去碘液并将玻片倾斜连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色再水洗，滴加番红复染5min洗去涂片上的番红染液，晾干。分别用不同倍数的显微镜镜检。

1.3.2 复筛

（1）糖发酵试验[3]。取葡萄糖、乳糖、白砂糖3种糖发酵半固体培养基，分装试管，高度为4～5cm。用接种环以无菌操作从培养于MRS培养基的疑似菌落中挑取菌种穿刺接种，置于37℃下培养2～3d，观察有无培养基变色现象。

（2）平板菌落计数法。大部分保加利亚乳杆菌在普通肉汁培养基上形成小点状菌落，特别是当样品中乳杆菌的数量远远高于链球菌的情况下，这些小粗糙菌落通常是羊毛状或模糊不清的，它们很容易用肉眼使其同光滑凸起的嗜热链球菌大菌落区别开来[4]。操作时，对三剑客酸奶10-4梯度、三剑客老酸奶10-4梯度的稀释菌液取样，尽快向上述盛有不同稀释液的平皿中对号倒入融化后冷却至45℃的MRS培养基和普通肉汁培养基约15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。待培养基凝固后，将MRS培养基厌氧条件下37℃培养48h和普通肉汁培养基需氧条件下37℃培养48h后，取出培养基，算出同一菌液3个平板上的乳酸菌总菌数并计算杆球比。

1.4 酸奶中乳酸菌的鉴定

形态学鉴定[5]：对分离到的球菌和乳杆菌分别进行糖发酵试验；

生理生化试验：依据伯杰氏细菌鉴定手册（第8版）中的方法对几种乳杆菌和乳酸链球菌进行温度、pH值、发酵糖特性等方面的检测，鉴定出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

三剑客酸奶1×10-4梯度在MRS和普通肉汁培养基上的菌落见图1，普通肉汁培养基三剑客老酸奶10-4梯度下的菌落见图2。

图1 三剑客酸奶1×10-4梯度在MRS和普通肉汁培养基上的菌落

图2 普通肉汁培养基三剑客老酸奶1×10-4梯度下的菌落

经观察，MRS培养基4个平板上1×10-4稀释度为最佳（见图1左），普通肉汁培养基4个平板上1×10-4稀释度为最佳（一般在培养基上长出30～300个菌落的稀释度为最佳，见图1右）。利用MRS培养基分离的菌株，菌落较大、透明、灰白色、两面凸起、呈不规则的形态，菌落的直径为1～3mm，细胞两端钝圆，呈细杆状，即为乳杆菌。用普通肉汁培养基分离出的菌种，两面凸起且呈不规则的圆形或椭圆形，菌落的直径为1～2mm，球形或卵圆形，即为乳球菌。

2.2 单菌落革兰氏染色

双筒生物显微镜下的乳杆菌见图3，双筒生物显微镜下的乳球菌见图4。

图3 双筒生物显微镜下的乳杆菌

图4 双筒生物显微镜下的乳球菌

经观察，从MRS培养基挑取出的单菌落进行染色，镜检为革兰氏阳性菌，呈杆状；从普通肉汁培养基上挑取出的单菌落进行染色，镜检为革兰氏阳性菌，呈球状。

2.3 酸奶中乳酸菌形态学观察和生理生化鉴定结果乳酸菌形态学观察和生理生化鉴定结果见表1。

表1 乳酸菌的形态学观察和生理生化鉴定结果

对分离到的乳球菌进行糖发酵试验，结果表明葡萄糖、白砂糖发酵试管中培养基由紫色变为黄色，并且45℃也能生长的即为嗜热链球菌。

对分离到的乳杆菌进行糖发酵试验，结果表明乳糖发酵试管中培养基由紫色变为黄色，其余2种糖发酵培养基均未变色的菌落为保加利亚乳杆菌。

2.4 不同酸奶中乳酸菌总数比较

三剑客酸奶和三剑客老酸奶的1×10-4稀释液在

2种培养基下的乳酸菌总数见表2。

表2 三剑客酸奶和三剑客老酸奶的10-4稀释液在2种培养基下的乳酸菌总数

酸奶国家标准（GB2746—1999）中乳酸菌数不得低于1×10-6CFU/mL。试验研究的鹤壁市市售的三剑客酸奶和老酸奶适宜稀释度菌液经培养后，培养基内可见菌落数达到了国家标准，且杆球比结果1∶1也达到了国家标准。

3 结语

此次试验对鹤壁市2种酸奶的乳酸菌总数和杆球比作了分析，从乳酸菌的含量看，2种酸奶均达到国家标准要求，为人们消费和企业生产提供合理化建议。

[1]凌代文，东秀珠．乳酸细菌分类鉴定及试验方法[M]．北京：中国轻工业出版社，1999：53-60.

[2]霍贵成．乳酸菌的研究与应用[M]．北京：中国轻工业出版社，2007：27.

[3]邬敏辰．食品工业生物技术[M]．北京：化学工业出版社，2005：73.

[4]朱明，姚茂军．食品工业分离技术[M]．北京：化学工业出版社，2005：68-92.

[5]伍时华，黄翠姬，石缓靖，等．酸乳菌种分离纯化方法[J]．食品科学，2004，25（10）：162-166.◇

TheSeparationandIdentificationofLacticAcidBacteria fromtheYogurtSoldinHebiCity

MENGXiaohua
（HebiPolytechnic，Hebi，He'nan458030，China）

MRSculturemediumandordinarymeatmediumplatecoatingmethodareusedtoseparatelacticacidbacteriafrom differentsunjockdairyinHebicity，whilegramstainingusedinpreliminaryidentification.Sugarfermentationexperimentand physiologicalandbiochemicalidentificationareusedinspeciesidentification，throughplatecountmethodtocalculatecolony countindifferentyoghurtandtheleverthantheball.Theresultsshowthatthenumberoflacticacidbacteriainsunjockold yogurtishigherthansunjockyogurt.

yogurt；lacticacidbacteria；gramstaining；sugarfermentationtube

R155.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.039

1671-9646（2017）04b-0040-03

2017-03-29

孟晓华（1987—），女，硕士，助教，研究方向为食品化学与营养。