草鱼鱼皮胶原蛋白与NIH3T3成纤维细胞的相容性

余 兰 汪海波 陈 卓 方 成*

1(武汉轻工大学移植工程实验室，武汉 430023)2(武汉轻工大学化学与环境工程学院，武汉 430023)

草鱼鱼皮胶原蛋白与NIH3T3成纤维细胞的相容性

余 兰1汪海波2陈 卓1方 成1*

1(武汉轻工大学移植工程实验室，武汉 430023)2(武汉轻工大学化学与环境工程学院，武汉 430023)

体外检测草鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白(FASC)的细胞相容性。采用MTT实验，检测不同浓度的FASC溶液或FASC涂层胶对NIH3T3成纤维细胞增殖能力的影响(n=6)；利用transwell趋化实验，检测不同浓度的FASC溶液对成纤维细胞的趋化作用(n=3)；利用transwell侵袭实验，检测不同浓度FASC涂层胶的细胞通透性(n=3)。结果表明，FASC溶液浓度依赖性地促进NIH3T3成纤维细胞增殖，16 μg/mL的FASC溶液在48和96 h的增殖率分别为63.7%±7.9%和87.3%±8.7%，较对照组有显著性差异(P<0.001)。NIH3T3细胞能够在FASC涂层胶上生长，各实验组与对照组相比，增殖率均无显著性差异(P> 0.05)。趋化实验显示，FASC溶液各浓度梯度组与阴性对照组的趋化指数均有显著性差异(P< 0.05)，提示FASC对成纤维细胞具有趋化作用。侵袭实验结果显示，成纤维细胞可以通过FASC涂层胶。实验证实，FASC与NIH3T3细胞具有良好的相容性。

胶原蛋白；鱼皮；草鱼；成纤维细胞；细胞相容性

引言

理想的生物创伤材料应能为细胞的黏附、生长提供合适的空间结构、力学支持，并可以模拟细胞生长的微环境[1]。哺乳动物胶原蛋白作为天然的细胞外基质的主要成分，为细胞的黏附、迁移和增殖提供了必要的生物环境[2-4]。海绵状Ⅰ型胶原蛋白材料与细胞外基质具有极为相似的三维空间结构，用于大范围组织缺损修复的再生基质[5-6]。人工生物材料具有增强诱导及减少重构的作用，但更重要的作用是利于细胞增殖和分布，这要求材料具备生物相容的综合性能[7]。在前期研究中已经初步确定，鱼皮胶原蛋白在动物体内具有良好的组织相容性[8]。本研究将草鱼鱼皮胶原蛋白与NIH3T3成纤维细胞进行体外共培养，用以验证其细胞相容性。

1 材料和方法

1.1 材料

草鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白(fishskin acid-soluble collagen, FASC)海绵，用草鱼鱼皮经乙酸提取法经冷冻干燥制得[9]；NIH3T3成纤维细胞(武汉大学细胞典藏中心)；胎牛血清(杭州四季青)；双抗、DMEM培养基、胰酶、IL-8趋化因子(美国Sigma)；结晶紫(武汉博士德)；Transwell趋化小室(美国康宁)；酶标仪(美国伯乐)；倒置显微镜(重庆明光)。

1.2 FASC溶液与细胞共培养的MTT实验

用1%醋酸5 mL将5 mg FASC海绵溶解，然后在4℃、20倍体积的PBS液中透析24 h(透析袋的截留分子量为大于14 kD)，再将透析过的溶液配制成浓度为0.5 mg/mL的FASC母液。

当NIH3T3细胞传至第3代时，将单层NIH3T3细胞用胰酶消化，吸去消化液后，再用含10%胎牛血清的DMEM配制成5×104个/mL的细胞悬液用于实验。实验组细胞悬液含FASC的质量终浓度分别为2、4、8、16 μg/mL，同时设阴性空白对照组(只加入细胞悬液)和本底调零孔(只加入DMEM溶液)。在96孔细胞培养板中，各组均设置6个平行孔，每孔加入100 μL上述液体，水平轻摇使其混匀。放入37℃、5% CO2培养箱中，分别培养48和96 h后，每孔加入20 μL的MTT试剂，4 h后吸去MTT溶液，加入150 μL的DMSO，10 min后测定490 nm的OD值并计算增殖率[10]。细胞增殖率=[(实验组OD值-本底OD值)/(阴性对照组OD值-本底OD值)-1] ×100%。

1.3 FASC涂层胶与细胞共培养的MTT实验

称取70 mg FASC海绵粉碎后置于10 mL的10%醋酸溶液中，微波炉加热15 min使其完全溶解，用NaOH调节pH至7，制备成含FASC质量浓度为7 mg/mL 的母液。再用母液配制质量浓度为1、3、5、7 mg/mL的FASC溶液，分别加入96孔板中，各浓度均重复6孔，每孔加入50 μL，使FASC溶液铺满孔底，同时设立空白对照组。再把该装置放入-20℃的冰箱里冷冻过夜，随后放入-50℃的冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，用75%的乙醇消毒后，在紫外光下风干制成不同质量浓度的FASC涂层胶，用于MTT实验。

在上述制备的FASC涂层胶的96孔板中，每孔加入100 μL密度为5×104个/mL的细胞悬液，后续步骤与本文第1.2节的实验步骤一致，最后测定各组在490 nm的OD值。

1.4 Transwell趋化实验

当NIH3T3成纤维细胞传代至第三代时，用来做趋化实验。在趋化小室的上室加入200 μL无血清DMEM的细胞悬液(密度为2×105个/mL)，下室加入500 μL不同浓度的FASC-DMEM混合溶液，实验组FASC浓度为(2、4、8、16 μg/mL)。同时，设立阴性对照组(下室加入500 μL无血清培养基)和阳性对照组(下室加入500 μL含IL-8浓度为10 ng/mL的无血清培养基)，每组均设置3个平行孔。放入37℃、5% CO2细胞培养箱，培养24 h后取出趋化小室，吸去上室细胞悬液，用PBS洗3次，再加入0.25%胰酶消化2 min后，用无菌棉签拭去Transwell聚碳酸酯膜上面的细胞。将聚碳酸酯膜下面浸入4%多聚甲醛固定20 min，用结晶紫染色3 min，在200倍倒置显微镜下，每孔随机选取5个视野计数趋化到小室下室膜的细胞数，并计算趋化指数(chemotatic index, Ci)[11]。Ci=各观察组下室细胞数/空白组下室细胞均数。

1.5 Transwell侵袭实验

按照本文第1.3节的实验方法，配制质量浓度为1、2、3 mg/mL的FASC溶液，将配制好的FASC 溶液依次加入Transwell上室中，每孔加入FASC溶液100 μL，均匀平铺于Transwell上室底，同时设立空白对照组，每组均设置3个平行孔。将趋化小室放入-20℃冰箱冷冻过夜，之后转入-50℃的冷冻干燥机冷冻干燥24 h，用75%的乙醇消毒后在紫外光下风干，制成不同质量浓度的FASC涂层胶用于侵袭实验。

做侵袭实验前，先将Transwell趋化小室的上下室各加入400 μL培养基，放入37℃、5% CO2培养箱里孵育过夜，再取出吸去培养基用无菌PBS洗2～3次，此步骤为水化FASC涂层胶。随后，在上室加入200 μL无血清DMEM的细胞悬液(密度为2×105个/mL)，下室加入IL-8浓度为100 ng/mL的DMEM溶液500 μL，按照本文第1.4节的实验步骤培养、染色；200倍倒置显微镜下，每孔随机选取5个视野计数侵袭到小室下室膜的细胞数，并计算侵袭指数(invasive index, Ii)。Ii=各观察组下室细胞数/空白组下室细胞均数。

1.6 统计学方法

统计分析使用 Prism (4. 00) 软件，样本均数及其随机误差用(均数±标准误)描述。多组样本间比较使用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较使用t检验。所有统计分析使用双侧比较，P<0.05则差异具有显著性。

2 结果

2.1 细胞在FASC溶液中的增殖情况

OD490值越高，表示活细胞数目越多。如图1所示，实验组的吸光度呈浓度依赖性(P<0.05)，NIH3T3成纤维细胞增殖率与FASC浓度呈正相关。16 μg/mL的FASC溶液在48和96 h的增殖率分别为(63.7 ± 7.9)%、(87.3 ± 8.7)%，较空白对照组有显著性差异(P<0.001)。实验结果显示，FASC溶液有促成纤维细胞增殖的作用。

图1 NIH3T3细胞与FASC溶液共培养MTT实验的OD值和增殖率Fig.1 The OD values and the proliferation rates of MTT tests for co-culturing of NIH3T3 fibroblasts and FASC solutions

2.2 细胞在FASC涂层胶上的增殖情况

从图2可以观察到，NIH3T3成纤维细胞能够在不同质量浓度的FASC涂层胶上生长，各实验组与对照组OD值两两比较无显著差异(P>0.05)，实验组两两比较OD值无显著差异(P>0.05)，说明FASC涂层胶不干扰细胞增殖。这是因为FASC涂层胶是通过高温热变性制得的，已经失去胶原蛋白活性。它类似于侵袭实验中Transwell小室膜上可使用的Matrigel胶，在培养时间4 d内不被降解[12]。FASC胶作为成纤维细胞粘附的基质，不干扰成纤维细胞正常生长。

图2 NIH3T3细胞与FASC涂层胶共培养MTT实验的OD值Fig. 2 The OD values of MTT tests for co-culturing of NIH3T3 fibroblasts and FASC coating gums (P>0.05)

2.3 FASC溶液对NIH3T3细胞的趋化性

在倒置显微镜下可见，经结晶紫染色的NIH3T3成纤维细胞呈紫红色，散在分布于趋化小室微孔膜下面(见图3)。实验组随着FASC溶液浓度的升高，趋化到膜下的细胞数量也增多，各实验组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明FASC溶液对NIH3T3成纤维细胞的趋化能力与质量浓度呈正相关(见图4)。同时，趋化指数与FASC溶液浓度也呈正相关(P<0.05)(见图4)。

图3 趋化实验形态(浅色箭头：Transwell膜的微孔；深色箭头：趋化到膜下面的细胞)。(a) 阴性对照组；(b) 阳性对照组；(c) 2 μg/mL FASC溶液组；(d) 4 μg/mL FASC溶液组；(e) 8 μg/mL FASC溶液组；(f) 16 μg/mL FASC溶液组Fig. 3 The morphology of chemotatic experiments (The red arrow indicates a micropore of transwell membrane; the black arrow indicates a cell transiting membrane). (a) Negative control group; (b) Positive control group; (c) 2 μg/mL FASC solution group; (d) 4 μg/mL FASC solution group; (e) 8 μg/mL FASC solution group; (f) 16 μg/mL FASC solution group

图4 向FASC溶液趋化并通过膜的NIH3T3细胞数和趋化指数(与对照组相比，*表示P<0.05,**表示 P<0.01)Fig.4 The counts and chemotatic indexes of NIH3T3 fibroblasts transiting through membrane towards FASC solutions(Compared with negative group, * indicates P<0.05, ** indicates P<0.01)

2.4 FASC涂层胶对NIH3T3细胞的通透性

在显微镜下可见，成纤维细胞能够透过FASC涂层胶侵袭到小室下面(见图5)。随着FASC涂层胶的浓度增加，趋化到小室下室膜的细胞数量减少，侵袭指数随FASC涂层胶的浓度增加而降低(见图6)。实验组之间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明FASC涂层胶对细胞的通透性与其质量浓度呈反相关。

图5 侵袭实验形态(浅色箭头：Transwell膜的微孔；深色箭头：趋化到膜下面的细胞)。(a) FASC涂层胶；(b) 阴性对照组；(c) 1 mg/mL FASC涂层胶；(d) 2 mg/mL FASC涂层胶；(e) 3 mg/mL FASC涂层胶 Fig.5 The morphology of invasive experiment(The red arrow indicates a micropore of transwell membrane; the black arrow indicates a cell transiting membrane). (a) FASC coating gum; (b) Negative control group; (c) 1 mg/mL FASC coating gum; (d) 2 mg/mL FASC coating gum; (e) 3 mg/mL FASC coating gum

图6 通过FASC涂层胶到下室膜的NIH3T3侵袭指数(与对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)Fig.6 The invasive indexes of NIH3T3 fibroblasts transiting through FASC coating gums to the bottom chamber membrane (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with negative group)

3 讨论

胶原蛋白材料在软骨、腱、脂肪、皮肤、牙周膜、角膜等组织工程以及药物缓释载体、创面敷料、体外细胞扩增等生物医学领域均有所利用[13]。哺乳动物胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分，同时亦是细胞黏附、增殖、分化的基质，具有优良的生物相容性、低抗原性，能够承载不同类型的细胞，是应用较为广泛的生物材料，在组织工程研究中日益受到瞩目[14]。成纤维细胞有维持组织结构和参与损伤修复的功能，在组织损伤过程中，成纤维细胞在各种活化因素(如低氧、内毒素等)的作用下，发生增殖、迁移、活化，并分泌各种细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等[15]。研究表明，成纤维细胞的适度增殖可以促进炎症消退。在炎症反应初期，成纤维细胞与白细胞相互作用，加强白细胞的活化与增殖，同时成纤维细胞分泌细胞因子及黏附分子作用于白细胞，促进其进入淋巴组织，最终可使炎症消退。在炎症过程中，中性粒细胞与成纤维细胞的黏附作用可以促进中性粒细胞凋亡，成纤维细胞也有类似于巨噬细胞的吞噬作用，能吞噬凋亡的中性粒细胞，最终可使中性粒细胞清除，从而促进炎症成功地消退[16]。正常功能的成纤维细胞，能抑制单核细胞的增殖能力，防止炎症的扩大，同时成纤维细胞及其分泌物可起到防止病原菌的感染扩散、介导免疫反应等良性作用。因此，促进成纤维细胞适度增殖对于慢性炎症的恢复有积极的意义[17]。

本研究发现，非变性FASC溶液促进NIH3T3细胞的增殖，即溶液状态的FASC具有促成纤维细胞生长活性[18]。而作为细胞黏附基质的热变性FASC涂层胶无细胞毒性及增殖刺激性，不干扰成纤维细胞的正常生长。FASC的特性能保障炎症过程中成纤维细胞的适度增殖，并防止炎症的扩大[19]。炎症后期成纤维细胞通过分泌细胞外基质来修复组织损伤[20]。另外，在趋化实验中发现FASC对成纤维细胞有趋化性，这说明FASC有类似于趋化因子的功能，在组织损伤过程中胶原蛋白可以诱导成纤维细胞聚集，促进后者的增殖和胶原合成[21]。侵袭实验显示，FASC涂层胶对成纤维细胞有通透性，在趋化因子的作用下成纤维细胞能够通过FASC涂层胶的孔径迁移到小室膜下面，通过的细胞数量与FASC涂层胶的质量浓度成反相关。侵袭实验证实，FASC胶具有一定的通透性[22]。随着FASC涂层胶质量浓度的增加给细胞迁移带来的阻碍更大，细胞更难以穿过FASC涂层胶的孔径[23]。以上实验证实，FASC在体外与NIH3T3成纤维细胞的生物相容性良好。

4 结论

中国渔业的资源较丰富，可为鱼皮胶原的开发供给充足的原料，具备开发安全、经济的胶原材料的潜力。但鱼皮胶原蛋白应用于生物医学材料领域的研究有待系统开展，特别是相关材料的生物相容性有待验证。本研究通过细胞增殖实验、趋化实验、侵袭实验，验证了未变性的FASC溶液促进成纤维细胞增殖且具有趋化作用。热变性的FASC涂层胶不干扰细胞增殖并具有一定的通透性，可作为基质供细胞黏附。所用草鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白(FASC)材料无细胞毒性，可供成纤维细胞黏附、迁移，具有细胞相容性优势，可以作为组织植入或敷盖材料进行开发利用。

(致谢：感谢硕士研究生吕楚风和谭容容参与本研究的细胞培养工作。)

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The Cytocompatibility of Ctenopharyngodon Idellus Fishskin Collagen with NIH3T3 Fibroblasts

Yu Lan1Wang Haibo2Chen Zhuo1Fang Cheng1*

1(LaboratoryofTransplantEngineering，WuhanPolytechnicalUniversity，Wuhan430023，China)2(CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering，WuhanPolytechnicalUniversity，Wuhan430023，China)

This study is aimed to test the cytocompatibility of fishskin acid-soluble collagen (FASC) of ctenopharyngodon idellus in vitro. The proliferation rates of NIH3T3 fibroblasts were detected using different concentrations of FASC solutions or coating gums by MTT experiment (n=6). The chemotaxis of fibroblasts towards FASC solutions were tested by chemotactic experiments of transwell (n=3). The cellular permeabilities in different concentrations of FASC coating gums were detected by invasive experiments of transwell (n=3). FASC solutions promote proliferation of NIH3T3 fibroblasts and the growth activity of the fibroblasts was dose-dependent on FASC. The proliferation rates of 16 μg/mL FASC solution in 48 and 96 h were (63.7±7.9)% and (87.3±8.7)%, that showed significant differences compared with the control group (P<0.001). NIH3T3 fibroblasts grew on FASC coating gums without significant differences compared with the control group (P>0.05). The chemotatic indexes showed significant differences between the concentration gradient groups of FASC solutions and the control group(P<0.05), which indicated that FASC has chemotaxis to fibroblasts. Invasion experiments showed fibroblasts could pass through FASC coating gums. These experiments confirmed that FASC possesses favourable cytocompatibility with NIH3T3 fibroblasts.

collagen; fishskin; ctenopharyngodon idellus; fibroblasts; cytocompatibility

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 02.011

2016-04-27， 录用日期:2016-07-11

国家自然科学基金(21376183)；湖北省自然科学基金(2015CFC845)

R318

A

0258-8021(2017) 02-0205-06

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: fang_cheng@foxmail.com