运动或电针预处理对脑梗死大鼠神经功能缺损及层粘连蛋白表达的影响

唐强，阮野，李宏玉，叶涛，吴孝军，田源，朱路文

运动或电针预处理对脑梗死大鼠神经功能缺损及层粘连蛋白表达的影响

唐强1，阮野2，李宏玉2，叶涛2，吴孝军2，田源2，朱路文1

目的探讨运动预处理与电针预处理对局灶性脑梗死大鼠神经功能的影响及其可能机制。方法24只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为模型组(n=6)、假手术组(n=6)、运动预处理组(n=6)和电针预处理组(n=6)。模型组、假手术组不行任何处理；运动预处理组行跑台训练2周，电针预处理组行电针预处理2周。采用改良线栓法制作大鼠局灶性脑梗死模型，假手术组行相同血管结扎，不造成梗死。24 h后采用改良神经功能缺损评分(NSS)对大鼠进行评定，Western blotting检测脑缺血区层粘连蛋白的表达。结果假手术组未见神经功能缺损表现，预处理组NSS评分低于模型组(P<0.05)，两预处理组间无显著性差异(P>

局灶性脑梗死；预处理；运动；电针；神经功能；层粘连蛋白；大鼠

[本文著录格式]唐强，阮野，李宏玉，等.运动或电针预处理对脑梗死大鼠神经功能缺损及层粘连蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(3):288-291.

CITED AS:Tang Q,Ruan Y,Li HY,et al.Effects of exercise or electroacupuncture preconditioning on neurological deficits and expression of laminin in rats with cerebral infarction[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):288-291.

脑血管疾病已成为我国乃至世界范围最常见致死疾病之一，具有低治愈率和高致残率的特点[1-2]。脑梗死发作约占全部脑血管疾病发病的60%~80%，是脑血管疾病的重要组成部分，我国每10万人口有约110人曾经历此病[2]。既往研究多集中于脑梗死后神经功能的康复方面，而如何有效预防脑梗死，减少发病后神经功能缺损，探讨有效的防治措施是目前临床医学和预防医学研究的重要课题。

近年来有针对脑梗死的多种预处理研究，主要集中于缺血预处理、短暂高温预处理、皮质扩散抑制、运动预处理等几个主要方法。但前三种方法都对实验对象造成不同程度创伤，临床应用不便。运动作为一种低伤高效的预处理方法无疑在各种方法中更有显著的优势[3]。

针刺已成为现代临床针对脑梗死疾病的重要治疗手段，电针作为现代针刺技术的改进，对脑梗死的预防和治疗作用已经得到诸多临床与动物实验证实[4-5]。

层粘连蛋白(laminin,LN)主要存在于基膜结构中，是基膜特有的非胶原糖蛋白，是细胞外基质的主要成分，主要对基膜的组装起作用，并在细胞表面形成网络结构，使基膜和细胞紧密结合。基膜是血脑屏障的主要组成部分之一，LN的改变直接关系到血脑屏障通透性的改变[6-7]。LN还具有诸如促进成年动物受损神经修复和再生等作用。

本研究观察不同预处理方法对脑梗死后大鼠神经功能缺损情况及LN表达的影响，对两种方法在单一时间点上进行比较，并探讨预处理对脑梗死疾病产生影响的相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

成年雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠24只，体质量(220±30)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证编号SYXK(黑)2010007。分为模型组(n= 6)、运动预处理组(n=6)、电针预处理组(n=6)和假手术组(n=6)。

1.2试剂与仪器

LN多克隆抗体：SANTA CRUZ公司。TEMED：AMRESCO公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。预染蛋白Marker：索莱宝公司。β-action抗体、羊抗兔IgG-HRP二抗：博奥森公司。

PAC 1000型电泳仪、转膜槽：Bio-RAD公司。超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司。超低温高速离心机：江苏南京温诺仪器设备有限公司。微量移液器：上海佳安分析仪器厂。华佗牌0.5寸一次性针灸针：苏州医疗用品有限公司。

1.3造模及干预方法

模型组大鼠参照改良Longa线栓法[8]建立永久性大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。大鼠2%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，于右侧胸锁乳突肌与二腹肌前头之间暴露颈总、颈外及颈内动脉，将用石蜡包被过头端的鱼线由颈总动脉送入颈内动脉，直达大脑中动脉起始处，阻断其血流供应，结扎缝合。大鼠苏醒后观察其行为变化，以提尾测试出现肢体向一侧卷曲，行走测试出现向患侧转圈为造模成功。

假手术组暴露分离颈部各动脉，行与模型组相同的血管结扎后即进行缝合，不插入鱼线。

运动预处理组造模前进行动物实验跑台适应性训练3 d，每天30 min，坡度0°，第1天8 m/min，第2天12 m/min，第3天15 m/min。淘汰无法配合跑台训练的大鼠并补入。正式训练每天30 min，坡度0°，速度15 m/min，训练6 d休息1 d，共2周。MCAO造模方法同模型组。

电针预处理组造模前行电针预处理2周，每次电针间隔24 h，6 d休息1 d。大鼠2%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔注射麻醉，放置于恒温手术台面上，温度37~ 39℃。一次性无菌针灸针于两耳连线中点处进针，向鼻尖方向平刺约5 mm，针尖抵达帽状腱膜下层，使用SD2-Ⅴ型电子针疗仪，两电极分别置于针柄和大鼠右耳根部，疏密波，频率2/15 Hz，强度以右耳出现轻微震颤为度，确认刺激达到标准后持续30 min。预处理过程中需保证实验动物安静、温暖。电针完毕后放回笼中待其自动苏醒。期间注意大鼠生命体征。两周后行MCAO造模，方法同模型组。

1.4神经功能评定

所有大鼠于MCAO术后24 h，采用改进的14分制神经功能缺损评分(Neurological Severity Scores, NSS)[9]进行神经功能缺损评定。

1.5Western blotting

所有大鼠于神经功能评定后麻醉处死，从颈椎处剪断皮肤、肌肉及颈髓，剪开头部皮肤暴露颅骨，止血钳剥离颅骨，剔除硬脑膜，期间避免划伤脑组织。将脑与颅底组织慢慢分离取下，液氮保存。

取出脑组织，放入预冷研钵充分短时研磨，加入蛋白裂解液5 ml/g至研钵冲洗研磨好的组织，充分混匀后将悬液放入EP管中，加1%PMSF 17.4 mg/ml、0.2%Leupeptin 1 mg/ml、0.1%Pepstatin A 5 mg/ml，冰浴20 min，确保裂解充分；14,000 r/min 4℃离心20 min，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)定量检测各标本总蛋白。

将测定好浓度的细胞裂解液(含蛋白40 μg)与4×sample buffer混匀，置100℃水中5 min，500 r/min离心3~5 s，室温冷却，将蛋白Marker和样品依次加到凝胶上样孔中，空余的上样孔用1×sample buffer补齐。行SDS-PAGE电泳，先将电压调至恒压80 V，当溴酚蓝指示的前沿离开浓缩胶后，再调整电压至恒压120 V，直至蓝色前沿跑出，结束电泳。预先将PVDF膜在甲醇中浸泡5~10 min，使之激活。湿法将凝胶转移至电转夹中，使胶位于阴极，PVDF膜位于阳极，胶和膜的两侧分别放置3~4层滤纸和海绵，紧密固定之后置于电转槽中，注入transfer buffer，冰上以200 mA转膜2 h。将转有蛋白的PVDF膜放入杂交袋中，加入3%BSA-TBST封闭液，封好口，翻转仪上平缓翻转，37℃封闭2 h。将LN一抗(1∶1000)用3% BSA-TBST封闭液稀释，将PVDF膜与抗体稀释液置于杂交袋中，4℃翻转孵育过夜。TBST洗涤PVDF膜3~4次，每次10~15 min。3%BSA-TBST封闭液稀释羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2000)，将PVDF膜与抗体稀释液置于杂交袋中，37℃翻转孵育1.5 h。TBST洗涤PVDF膜3~4次，每次10~15 min。按照ECL增强发光液试剂盒说明书配制曝光液(现用现配)，向PVDF膜上滴加ECL增强发光液显色曝光。内参β-action稀释比1∶1000，检测过程同LN一抗。检测结果采用Quantity One图像分析软件进行定量分析。每组条带分别进行3次分析，以模型组灰度为1，得到其余3组的蛋白表达相对灰度。

1.6统计学分析

采用Graphpad Prism 5.0进行统计学分析。实验结果均以(±s)表示。采用单因素方差分析比较组间差异，两两比较采用LSD t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1神经功能评定

假手术组NSS评分为0。模型组NSS评分升高(P<0.05)；两预处理组NSS评分均低于模型组(P< 0.05)，运动预处理组评分较电针预处理组略低，但无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2Western blotting

假手术组LN表达最高，模型组LN表达降低(P< 0.05)，两预处理组表达较模型组升高(P<0.05)，运动预处理组LN表达较电针预处理组略高，但无显著性差异(P>0.05)。见图1、表1。

图1 各组大鼠LN表达

表1 各组大鼠NSS评分及LN表达

3 讨论

运动预处理作为缺血缺氧性脑病预处理形式中的重要一员，因其安全性、可操作性及显著效果而被接受，在研究中受到广泛关注。既往研究中[10-12]，脑梗死大鼠术前行运动预处理3周，可观察到脑内受损微血管的完整性和脑血流供应障碍得到改善。这种脑保护作用与其诱导脑缺血耐受，降低脑缺血后炎症反应、细胞凋亡相关[13-14]。进一步研究发现[15-16]，这种抗炎、抗凋亡作用是通过调控Toll样受体4/核转录因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)信号通路实现的。此外，运动预处理的脑保护机制还与抑制谷氨酸的过度激活、促进脑血管生成及神经再生等有关[17]。

电针为大众普遍接受的治疗脑梗死疾病的重要手段，其作为预处理方法具备很高的临床应用价值。既往研究证实[18-23]，电针预处理能通过调控NF-κB、Wnt/β-catenin及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等信号通路，起到缩小脑梗死面积、阻止半暗带神经元凋亡、促进病灶周围水肿吸收、抑制炎症反应和增强自噬的作用，为电针预处理的科学性和可行性奠定理论基础。

本研究显示，经运动或电针预处理的大鼠，神经功能缺损程度均较未经预处理的大鼠轻，与既往研究结果一致。表明采用这两种预处理方法2周均能在一定程度上抑制缺血缺氧环境对中枢神经系统的损伤，起到神经保护作用。

血脑屏障由基膜、毛细血管内皮结构及胶质膜共同构成，具有防止有害物质进入脑内，维持内环境相对稳定的作用，对中枢神经系统的生理状态具有重要意义。血脑屏障在脑缺血环境下通透性改变是脑水肿发生的重要原因[24]。LN是细胞外基质的重要成分，与Ⅳ型胶原一起构成基膜；因其能与细胞表面的特异性受体连接，使基底膜和细胞紧密结合，起保护、过滤作用，LN表达降低可导致血脑屏障通透性增高[25]。

研究显示[26]，LN表达于缺血发生后6 h开始降低，24 h降至最低，与脑缺血损伤后发生脑水肿最重的时间段(24~48 h)相符，提示LN的表达与血脑屏障通透性相关。本研究显示，经运动或电针预处理的脑梗死大鼠，LN表达降低程度减轻，提示血脑屏障较完整，从而发挥脑保护作用。

综上所述，本研究显示，运动或电针预处理均能对缺血环境下的神经功能起到保护作用，抑制LN早期表达的降低，从而使血脑屏障的通透性得到改善。在观察期间未观察到两者的作用有显著性差异，也未在LN后期表达回升并堆积的情况下进行比较。有待进一步研究。

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Effects of Exercise or Electroacupuncture Preconditioning on Neurological Deficits and Expression of Laminin in Rats with Cerebral Infarction

TANG Qiang1,RUAN Ye2,LI Hong-yu2,YE Tao2,WU Xiao-jun2,TIAN Yuan2,ZHU Lu-wen1
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

ZHU Lu-wen.E-mail:zhuluwen1983@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture or exercise preconditioning on neurological function after focal cerebral infarction in rats and the possible mechanism.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=6),sham group(n=6),exercise preconditioning group(n=6)and electroacupuncture preconditioning group(n=6).The model group and the sham group did not accept any treatment,while the exercise preconditioning group and the electroacupuncture preconditioning group accepted treadmill training and electroacupuncture for two weeks,respectively.Their middle cerebral arteries were occluded with modified Longa's approach,except the sham group that was ligated the same arteries but did not result in infarction.They were evaluated with Neurologic Severity Scores(NSS)24 hours after modeling,and the laminin expression in the ischemic area was detected with Western blotting.ResultsThere was no neurological deficit in the sham group.The NSS was lower in both preconditioning groups than in the model group(P<0.05),but was not significant different between preconditioning groups(P>0.05).The expression of laminin was the most in the sham group,and was more in both preconditioning groups than in the model group(P<0.05),but was not significant different between preconditioning groups(P>0.05).ConclusionPreconditioning with exercise or electroacupuncture can both reduce the neurological deficits in rats after focal cerebral infarction,which may associate with the protection of laminin from inhibition in early stage.

focal cerebral infarction;preconditioning;exercise;electroacupuncture;neurological function;laminin;rats

R743.32

A

1006-9771(2017)03-0288-04

2016-11-15

2017-01-13)

1.国家自然科学基金项目(No.81503666)；2.黑龙江中医药大学领军人才计划项目(No.2012RCL02)；3.黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(No.yjscx2016037)。

1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040。作者简介：唐强(1963-)，男，汉族，四川大竹县人，博士，教授，主要研究方向：神经系统疾病中医康复基础与临床研究。通讯作者：朱路文(1983-)，男，汉族，山东邹城市人，博士，副教授，主要研究方向：神经系统疾病中医康复基础与临床研究。E-mail:zhuluwen1983@126.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.008

0.05 )。假手术组层粘连蛋白表达最高，模型组较预处理组表达降低(P<0.05)，两预处理组间无显著性差异(P>0.05)。结论运动预处理与电针预处理均能降低局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损程度，可能与抑制层粘连蛋白早期表达降低有关。