孙林林,刘振刚,张志勇,陈扬,刘俊杰,付爱军,李建民
盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血大鼠学习记忆功能及海马CA1区自噬的影响
孙林林1,刘振刚1,张志勇2,陈扬2,刘俊杰1,付爱军2,李建民2
目的研究盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠学习记忆及海马CA1区自噬的影响。方法雄性Sprague-Dawley大鼠54只,随机分为假手术组、SAH组、药物组,各18只。颈内动脉刺破法造模,药物组造模成功后予盐酸法舒地尔10 mg/ kg腹腔注射,每天1次,假手术组和SAH组腹腔注射等量生理盐水,干预后6 h、24 h、72 h予穿梭箱试验;取海马CA1区组织HE染色观察细胞形态,免疫组织化学染色观察Beclin-1和微管相关蛋白l轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达。结果与假手术组相比,SAH组大鼠各时间点穿梭箱试验逃避反应次数减少(P<0.05),逃避反应时间延长(P<0.05);海马CA1区神经细胞数目减少(P<0.05),Beclin-1、LC3-Ⅱ表达增高(P<0.05)。与SAH组相比,药物组各时间点逃避反应次数增多(P<0.05),逃避反应时间减少(P<0.05);海马CA1区神经细胞增多(P<0.05),Beclin-1、LC3-Ⅱ表达进一步增多(P<0.05)。结论盐酸法舒地尔可改善SAH大鼠学习记忆功能,减少神经细胞损伤,增强海马CA1区自噬。
蛛网膜下腔出血;盐酸法舒地尔;学习记忆;自噬;大鼠
[本文著录格式]孙林林,刘振刚,张志勇,等.盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血大鼠学习记忆功能及海马CA1区自噬的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(3):257-262.
CITED AS:Sun LL,Liu ZG,Zhang ZY,et al.Effects of fasudil hydrochloride on learning and memory ability and autophagy in CA1 area of hippocampus in subarachnoid hemorrhage rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):257-262.
蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指颅内血管病变致使血液流入蛛网膜下腔,是比较常见的脑血管疾病,发病率随年龄增长而增加,老年发病较多,一般预后较差,是脑卒中猝死的最常见原因[1]。早期研究主要集中在血管痉挛方面,但治疗对预后的改善并不明显。新近研究表明,针对SAH早期脑损伤积极治疗,可明显改善患者的预后。文献报道[2-3],SAH早期的脑损伤通过细胞凋亡、细胞缺血及炎症反应等各种途径导致细胞的早期死亡。近期研究发现,神经系统疾病的发病机制与自噬有关,例如缺血性脑卒中[4]、脑外伤[5]等。可能是因为自噬可以维持内环境稳定,减少神经细胞的损伤和凋亡。
盐酸法舒地尔是临床比较常用的药物,其代谢产物为羟基法舒地尔,可影响神经细胞损伤、凋亡等病理生理改变。国外学者认为其对自噬的激活可能也发挥一定的作用。
本研究探讨盐酸法舒地尔对SAH大鼠学习记忆功能及海马CA1区Belin-1和微管相关蛋白l轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3 II, LC3-Ⅱ)的影响,为探索SAH的临床救治提供新思路。
1.1 仪器与试剂
手术显微镜、组织包埋机、HI1220烘片机:德国LEICA公司。BX53全自动显微镜扫描系统:日本OLYMPUS公司。穿梭箱:上海软隆科技发展有限公司。
盐酸法舒地尔:山西普德药业股份有限公司。自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ一抗:日本株式会社医学生物研究所。免疫组织化学二抗:ZSGB-BIO公司。苏木素、伊红、酒精:华北理工大学基础实验室。
1.2 动物与分组
华北理工大学动物实验中心提供SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠54只,月龄3~6个月,体质量360~470 g。自由进食水适应性饲养2周,实验前12 h取出准备,术前禁食水。
大鼠依次编码,随机数字表法分为假手术组、SAH组、药物组,各18只。各组再分为术后6 h、24 h、72 h共3个亚组,每个亚组6只。
1.3 模型制作
参考Muroi等[7]方法,采用颈内动脉刺破法制备大鼠SAH模型。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉,四肢及头部固定,颈部备皮,消毒铺洞巾;颈正中切口,暴露颈总、颈内、颈外动脉,结扎并离断颈外动脉,纤芯从颈外动脉残端刺入,进入颈内动脉,进入约2 cm后刺破血管,停留10 s左右,拔出纤芯,逐层缝合。保温复苏后继续饲养。
造模成功判断标准:①血管刺破感;②短暂的瞳孔散大;③剥离脑组织时肉眼可见血凝块散布环池、基底池部位。
假手术组不刺破血管,余操作同前。
造模成功缝合切口后,药物组予盐酸法舒地尔10 mg/kg腹腔注射,6 h和24 h组各给药1次,72 h组每24 h给药1次,共3次。
1.4 穿梭箱试验
大鼠术前1 d行穿梭箱训练2次。术后于预设时间,适应环境5 min后,予声光刺激5 s培养条件反射环境,再予1.5 mA交流电30 s电击,休息20 s后进行下次练习,循环30次。视频分析行为结果。记录逃避反应次数(大鼠受30 s电刺激时间内逃离危险区的次数)和逃避反应时间(大鼠受30 s电刺激时间内逃离危险区的平均时间)。
1.5 HE染色
穿梭箱试验后,每只大鼠予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉,心脏灌注生理盐水500 ml,4%多聚甲醛250 ml灌注固定取脑,4%多聚甲醛浸泡固定2 d。切取带有海马的脑组织,石蜡包埋,切片厚5 μm。每个组织块取3张带海马CA1区的切片,二甲苯、梯度酒精脱蜡,水化,苏木素染胞核,伊红染胞浆,梯度酒精、二甲苯脱水透明,封片。400倍光镜下观察海马CA1区神经细胞,随机选取6个视野采集图片,Motic-6.0软件计算正常形态神经细胞平均数。
1.6 免疫组织化学染色
每个组织取6张带海马CA1区的切片,二甲苯、梯度酒精脱蜡,水化,置柠檬酸钠溶液中高压修复,3%H2O2去离子水室温孵育8 min,滴加LC3-Ⅱ一抗(1∶100)、Beclin-1一抗体(1∶100),4℃冰箱过夜;滴加组化二抗,37℃恒温箱孵育30 min;梯度酒精、二甲苯脱水透明,封片。400倍光镜下观察海马CA1区神经细胞,随机选取6个视野采集图片,Motic-6.0软件计算阳性细胞平均数。
1.7 统计学分析
实验数据用EXCEL 2007软件建立数据库,SPSS 13.0软件对实验数据进行处理。所得数据均以(±s)表示,采用单因素方差分析,两两比较采用LSD t检验。显著性水平α=0.05。
2.1 穿梭箱试验
与假手术组比较,SAH组各时间点逃避反应次数减少,逃避反应时间增多(P<0.05)。与SAH组比较,药物组各时间点逃避反应次数增多,逃避反应时间减少(P<0.05)。见表1、表2。
2.2 HE染色
假手术组海马CA1区多正常形态神经细胞,排列整齐,胞核清晰,胞浆均匀。SAH组海马CA1区神经细胞核紫色深染,排列紊乱,梭形固缩多见;6 h亚组即可见核固缩、核碎裂,正常神经细胞数目减少;24 h亚组正常神经细胞数目更少,72 h亚组核固缩、核碎裂较明显,正常神经细胞数目最少。药物组与SAH组比较,各时间点正常神经细胞数目明显增多,核固缩、核碎裂明显减少。见图1、表3。
2.3 免疫组织化学染色
Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白阳性表现为细胞质中浅棕色、棕褐色颗粒。假手术组少数细胞质里可见阳性表达。SAH组6 h即可见细胞质中棕色颗粒,阳性细胞数量开始增多,24 h达到高峰,72 h减少。药物组各时间点Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数均比SAH组增多。见图2、图3及表4、表5。
图1 各组海马CA1区神经细胞形态(HE染色,bar=50 μm)
表1 各组术后不同时间穿梭箱试验逃避反应次数比较
表2 各组术后不同时间穿梭箱试验逃避反应时间比较(s)
图2 各组海马CA1区Beclin-1阳性细胞(免疫组织化学染色,bar=50 μm)
表3 各组术后不同时间海马CA1区存活神经细胞数比较(/高倍视野)
表4 各组术后不同时间海马CA1区Beclin-1蛋白阳性细胞数比较(/高倍视野)
图3 各组海马CA1区LC3-Ⅱ阳性细胞(免疫组织化学染色,bar=50 μm)
表5 各组术后不同时间海马CA1区LC3-Ⅱ蛋白阳性细胞数比较(/高倍视野)
盐酸法舒地尔是一种新型抑制钙离子、蛋白激酶、Rho激酶活性的异喹啉磺胺衍生物,具有很好的亲水和亲脂性。良好的亲脂性使其易于通过血脑屏障,舒张颅内血管平滑肌,抑制血管痉挛,改善脑组织灌注,改善细胞的缺血缺氧,有效保护神经细胞[8-9]。文献报道[10-11],SAH可损伤大鼠海马区神经细胞以及学习记忆功能。其作用机制可能是SAH后蛛网膜下腔间隙发生改变,激活Rho相关激酶,抑制肌球蛋白轻链的活性,导致肌球蛋白与肌动蛋白改变,引起颅内血管痉挛,脑组织缺血[12-14]。本研究显示,SAH后,大鼠行为能力变差,海马CA1区神经细胞形态改变明显,存活率下降,与此前结果一致。
本研究选用自噬相关蛋白Belin-1和LC3-Ⅱ作为检测自噬水平的标准,研究显示,SAH组海马CA1区自噬水平升高,药物组自噬水平更高,提示盐酸法舒地尔可明显增强神经细胞自噬。
自噬是一种程序性死亡方式,是溶酶体分解代谢的过程。适度的自噬可以维持真核细胞、组织及机体的内环境平衡,保护细胞并减少细胞死亡;自噬受到抑制会影响细胞生存,对机体产生损害[15-16]。叶红伟等[17]在大鼠心脏血管闭塞后给予法舒地尔干预,发现大鼠心肌细胞自噬明显增多,起到保护性作用。Gao等[18]证实,法舒地尔可激活心肌H9c2细胞自噬而减少凋亡,这种作用可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制,说明法舒地尔通过激活自噬发挥保护性作用。Zhao等[19]报道,应用自噬激活剂干预SAH大鼠,发现LC3-Ⅱ及Beclin-1表达增多,神经细胞凋亡明显减少;用自噬抑制剂干预后,神经功能损害加重。
目前关于盐酸法舒地尔对自噬影响的研究多集中于体外,体内研究较少,对于神经细胞的研究更少。本研究通过颈内动脉刺破法造模,对SAH大鼠进行体内试验,研究结果与上述文献报道一致。本研究未涉及具体作用机制,有待进一步研究。
综上所述,盐酸法舒地尔可能通过增强海马CA1区自噬,减少神经细胞的损伤,改善大鼠学习记忆功能。
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Effects of Fasudil Hydrochloride on Learning and Memory Ability and Autophagy in CA1 Area of Hippocampus in Subarachnoid Hemorrhage Rats
SUN Lin-lin1,LIU Zhen-gang1,ZHANG Zhi-yong2,CHEN Yang2,LIU Jun-jie1,FU Ai-jun2,LI Jian-min2
1.North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China
FU Ai-jun.E-mail:tsfaj@sina.com
ObjectiveTo investigate the effects of fasudil hydrochloride on learning and memory,and the autophagy in hippocampal CA1 neurons in subarachnoid hemorrhage(SAH)rats.MethodsFifty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=18),SAH group(n=18)and drug group(n=18).Subarachnoid hemorrhage model was established with internal carotid artery puncture.The drug group was injected fasudil hydrochloride 10 mg/kg intraperitoneally after modeling per 24 hours,while the sham group and SAH group were injected the same volume of saline.They were tested with shuttle box test 6,24 and 72 hours after intervention,then the hippocampal CA1 area was stained with HE and immunohistochemistry to observe the morphology of cells and the expression of Beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 II(LC3-II).ResultsCompared with the sham group,the frequence of avoidance decreased in SAH group at each time point(P<0.05),while the avoidance reaction time increased(P<0.05);the survival of neurons in hippocampal CA1 area decreased(P<0.05),and the expression of Beclin-1 and LC3-II increased(P<0.05).Compared with SAH group,the frequence of avoidance increased in the drug group at each time point(P<0.05),while the avoidance reaction time decreased(P<0.05);the survival of neurons in hippocampal CA1 area increased(P<0.05)and the expression of Beclin-1 and LC3-II increased further(P<0.05).ConclusionFasudil hydrochloride can improve learning and memory ability and protect neurons from damage,which may associate with the excess of autophagy activation in hippocampal CA1 areas in SAH rats.
subarachnoid hemorrhage;fasudil hydrochloride;learning and memory;autophagy;rats
R743.35
A
1006-9771(2017)03-0257-06
2016-12-11
2017-01-16)
河北省重大医学课题(No.ZD2013093)。
1.华北理工大学,河北唐山市063000;2.华北理工大学附属医院神经外科,河北唐山市063000。作者简介:孙林林(1989-),男,汉族,河南商丘市人,硕士研究生,医师,主要研究方向:脑血管病。通讯作者:付爱军,男,硕士,主任医师,主要研究方向:脑血管病。E-mail:tsfaj@sina.com。
10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.003