王氏唇柱苣苔的离体培养及遗传稳定性

李谦盛 赵伟 沈娟 周纯亮

摘 要 以王氏唇柱苣苔（Chirita wangiana）叶片为外植体进行组培离体快繁研究，并利用流式细胞术对组培苗进行遗传稳定性分析。结果表明：最佳初代诱导培养基为MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最适继代培养基为MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；最适生根培养基为1/2 MS培养基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖，所有生根培养基获得的组培苗移栽驯化成活率达到92%以上。组织学切片检测表明，王氏唇柱苣苔叶片为外植体所形成芽体均为器官发生方式形成。流式细胞术检测表明，组培苗倍性没有变化，基因组大小与母本相比仅发生了1.86%的减少；染色体数目为2n=36，跟母本一致，植株形态特征上也无变异。研究结果可为王氏唇柱苣苔的园艺应用快速提供大量遗传稳定的种苗。

关键词 王氏唇柱苣苔；组织培养；流式细胞术；染色体数

中图分类号 Q944.4 文献标识码 A

In vitro Rapid Propagation of Chirita wangiana

and Genetic Stability

LI Qiansheng*， ZHAO Wei， SHEN Juan， ZHOU Chunliang

School of Ecology，Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China

Abstract In vitro rapid propagation of Chirita wangiana using the leaf section as the explant was studied，and the genetic stability of the regenerated plantlets was analyzed by flow cytometry and chromosome number. The results showed that the most optimal bud induction medium was MS medium supplemented with 0.5 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA； the suitable subculture medium was MS medium with 0.5 mg/L 6-BA and 0.05 mg/L NAA； 1/2 MS medium supplemented with 15 g/L sucrose and 0.5 mg/L IBA was suitable for rooting. Histological investigation revealed that the buds and plantlets regenerated through organogenesis. Ploidy investigation by flow cytometry showed that there was no ploidy variation among the regenerated plantlets，though there was only a 1.86% decrease in the genome size. Both the mother plant and in vitro regenerated plantlets had the same chromosome numbers（2n=36）and unchanged morphological characteristics. The results could be used for large scale rapid propagation of genetic stable seedlings of C. wangiana in horticultural application.

Key words Chirita wangiana； tissue culture； flow cytometry； chromosome number

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.018

唇柱苣苔屬（Chirita Buch.-Ham. Ex D. Don）为苦苣苔科（Gesneriaceae）重要野生花卉，约140种，分布于不丹、中国南部、印度、尼泊尔、印度尼西亚、缅甸、马来西亚、泰国、越南等地，中国有99种[1]。唇柱苣苔属植物花叶俱美，条件适宜可四季开花，十分耐阴，适应性强，是良好的室内观赏花卉，也可作为花坛、花境和盆景应用，唇柱苣苔属植物在观赏方面的巨大潜力和价值越来越被园艺界所重视[2-3]。

王氏唇柱苣苔（Chirita wangiana Z. Y. Li）为唇柱苣苔属多年生草本植物，具根状茎，叶片厚纸质，椭圆形或卵状椭圆形，2～4×1.4～3.5 cm，莲座叶，叶片被稀疏绒毛；聚伞花序1～3朵，花序梗长4～4.5 cm，连同花梗被紫色短柔毛；苞片2（～3），常对生；花萼5裂，花冠长3～3.5 cm，白色，内面具紫色斑纹，花期7月，产于广西融安县[1]。王氏唇柱苣苔株型优美，叶色翠绿，十分耐阴，可作为极佳的室内盆花材料，与其它唇柱苣苔属植物一样在观赏方面的巨大潜力和价值越来越被园艺界所重视[2-3]。

唇柱苣苔属植物人工繁殖可以通过种子、扦插、分株和组织培养进行。种子繁殖受到种源和发芽率的限制，且幼苗生长较慢；扦插运用于具有肥厚革质、硬质叶片的种类效果较好[4]。如叶片为革质的园艺杂交品种卡柱苣苔（Chirita‘Kazu）叶片可进行分段式扦插，成活率高[5]。而叶片纸质或草质的寿城唇柱苣苔（Chirita shouchengensis）和心叶唇柱苣苔（Chirita cordifolia）扦插的生根率较低，分别只有69%和40%[6]，利用扦插繁殖这类唇柱苣苔受到一定限制。

建立高效稳定的外植体离体再生体系，可为苦苣苔科植物的园艺开发奠定基础；同时，通过组织培养建立稳定的遗传转化体系，可以开展利用转基因技术进行改良育种[7]。唇柱苣苔属组织培养有的以种子作为外植体消毒后进行无菌播种，如崀山唇柱苣苔（Chirita langshanica）[8]；也有以花梗为外植体的，如尖萼唇柱苣苔（Chirita pungentisepala）[9]、三苞唇柱苣苔（Chirita tribracteata）[10]、黄花牛耳朵（Chirita lutea）[11]；但多数以叶片作为外植体，诱导愈伤组织后分化产生不定芽，进而获得组培苗，如大苞短毛唇柱苣苔（Chirita brachytricha var. magnibracteata）[12]、条叶唇柱苣苔（Chirita ophiopogoides）[13]、文采唇柱苣苔（Chirita wentsaii）[14]、菱叶唇柱苣苔（Chirita subrhomboidea）[15]、荔波唇柱苣苔（Chirita liboensis）[16]等。这些唇柱苣苔组培快繁技术的成功，为唇柱苣苔属植物大规模园艺应用的种苗供应提供了技术保障，也为解决一些濒危唇柱苣苔属植物的迁地保育奠定了技术基础。而王氏唇柱苣苔尚未有组培快繁的研究报道，研发适合于王氏唇柱苣苔高效、稳定的组培快繁技术体系可为王氏唇柱苣苔的园艺开发和可持续利用提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

将采集于广西融安县的野生王氏唇柱苣苔引种栽培位于上海市奉贤区海湾的上海应用技术大学的实验温室内栽培，温室为1 000 m2的文洛型玻璃温室，配备内外遮阳，夏季通过湿帘风机系统降温，冬季通过暖风系统加温，最低夜温在10 ℃以上。引种植株正常生长后用于组培外植体取材（图1-A）。实验所用培养基除生根培养基为1/2 MS外，初代与继代阶段培养基均为MS培养基，培养基均加入3%蔗糖、0.6%琼脂粉、灭菌前pH调到6.0，分装后于121 ℃高温灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 ①外植体处理：将引种成活后的植株置于通风处1周后，取长约3 cm、宽2 cm的健壮无病斑嫩叶，用洗洁精轻轻擦洗后于流动的自来水下冲洗1 h；取该叶片放置于超净台下，先用70%酒精清洗10 s后用无菌水冲洗3次（每次15 s左右），再移入0.1%升汞中加1滴吐温20，振荡5～8 min，最后用无菌水漂洗7～10次。

②不定芽诱导和初代培养：起始培养基以MS+0.5 mg/L 6-BA为基本培养基，再分别添加0.1 mg/L NAA、IBA和IAA共4种培养基（表1）。选择消毒后无褐化的叶片作为外植体，切割成0.5 cm×0.5 cm的小块接入培养基中，每瓶5个外植体（图1-B），每种培养基5瓶。培养室温度为（25±2）℃，先暗培养1周后，而后置于光强为40 μmol/（m2·s）的组培架上，光照时间12 h。6周后统计外植体上的芽数。

③继代增殖：取初代培养基上培养6周后的幼苗叶片切成0.5 cm×0.5 cm的小块转接到MS空白以及含6-BA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和NAA（0、0.01、0.05 mg/L）正交组合设计的10种MS培养基上。每瓶接种5个叶块、每个培养基处理5瓶。每周进行观察、固定、拍照并统计生长情况，取生长6周产生的芽数进行统计分析。

④生根培养：将继代增殖培养6周的瓶苗接种分别转接至空白MS培养基上3周后，选择大小一致的试管苗，转接至含不同IBA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和蔗糖（15、30 g/L）浓度组合的1/2 MS培养基上。每瓶接种5株，每个培养基8瓶，统计生根率、平均根数和根长。2个月后随机选择其中20株，统计叶数、根数、根长、株高。

⑤炼苗移栽：植株冠幅达到3～4 cm时，将组培苗从瓶内取出，洗净根部的培养基，移栽到装满草炭、蛭石、珍珠岩体积比3 ∶ 1 ∶ 1混合基质的32孔穴盘中，浇透水，放入育苗盒中保湿。日后每隔3 d往育苗盒喷雾1次，保持空气湿度在90%以上，最高光照强度150 μmol/（m2·s），温度为18 ℃～25 ℃。2个月后统计成活率。

1.2.2 测定项目与方法 ①生长发育观察和形态学解剖：每周对外植体用体视显微镜（Olympus SXZ 1000）进行观察，对叶片外植体的形态拍照记录。对叶片外植体定期采用FAA固定液（70%酒精 ∶ 冰醋酸 ∶ 甲醛=90 ∶ 5 ∶ 5）进行固定。分别在接种前和接种后，每周从每个处理分别取一片叶片外植体，放于20倍体积的FAA固定液中，固定3 d后转入70%酒精中保存。将固定好的切片材料用酒精和二甲苯进行梯度脱水和透明后，进行梯度渗蜡，后采用Leica Plus 60 ℃溶点高纯度石蜡进行包埋。包埋好的石蜡块采用Leica R2015切片机切片，切片厚度8～10 μm。采用铁钒苏木精法染色后，用中性树胶封片，在Olympus BX51下进行观察和拍照。

②染色体计数：染色体计数材料采用驯化移栽前生长旺盛的组培苗。于早晨8点采集生长旺盛的根尖，在0.1%秋水仙素常温处理2 h后，卡诺固定液（无水酒精 ∶ 冰醋酸=1 ∶ 1）4 ℃固定2 h，用去离子水漂洗3次，用1 mol/L HCl 60 ℃解離2 min，蒸馏水清洗3～5次后，将根尖材料轻轻放于载玻片上，用解剖针分散根尖样品后，采用卡宝品红溶液在常温下染色3 min，盖上盖玻片，压片后，Olympus BX51显微镜镜检，观察和拍照。

③流式细胞术变异性检测：以自交系玉米（Zea mays L.）B73为内参，王氏唇柱苣苔母本与组培苗分别与玉米幼嫩的叶片共切，大小均约0.5 cm2，置于冰盒内的1次性培养皿中。加400 μLD API核提取液，使用尖锐的刀片快速切割样品，浸泡2～5 min之后将悬浮液用300目的尼龙网过滤到样品管中，再加入1 600 μL的染色液，转速14 000离心10 s后，去除上清液，加2 mL蒸馏水补给，随后于Partec Space型流式细胞仪上检测[17]。每种材料3个重复。

1.3 数据处理

利用SPSS 19.0对数据进行方差分析，采用邓肯氏新复极差法对试验结果进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 王氏唇柱苣苔初代培养

王氏唇柱苣苔在添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS培养基上，诱导启动所需时间短，平均诱导芽数却最多，首先在叶缘处长出芽点（图1-D），而后叶块中间也出现不定芽，芽均匀但较小（图1-C）；而仅有0.5 mg/L 6-BA的培养基对诱导不定芽时间最长，芽数则最少，但芽相对较大（表1）。

2.2 王氏唇柱苣苔的继代增殖培养

继代培养中未添加植物生长调节剂的MS空白培养基诱导芽数最少，平均为7.4个，且启动最晚，外植体边缘褐化。6-BA浓度对王氏唇柱苣苔叶片的继代增殖芽产生有显著影响，相同NAA水平下每个外植体产生的芽数随着6-BA浓度的提高而增加；而NAA浓度则影响不显著；6-BA与NAA的交互作用对增殖芽产生影响显著。最高诱导芽数是添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的MS培养基，芽数达到46.4个，芽小生长密集，但出现明显的玻璃化现象。在MS无激素培养基和低浓度6-BA（0.1 mg/L）培养基中，增殖过程中均出现生根现象。在0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的MS培养基上芽增殖也达到39个，且未出现玻璃化现象，因此，该培养基可作为最佳增殖培养基（表2）。

2.3 王氏唇柱苣苔的生根培养

王氏唇柱苣苔在不同生根培养基中幼苗均能100%生根（表3），除蔗糖浓度对叶数和根长没有显著影响外，IBA、蔗糖和IBA的交互作用对王氏唇柱苣苔的叶片数、根数、根长和株高均有显著影响，而蔗糖仅对根数和株高产生显著影响。王氏唇柱苣苔生根培养60 d后，单株叶片数可达到8～10.5片。在2种浓度蔗糖条件下，根数在IBA浓度为0.5 mg/L时显著增多，分别为18.6条和16条；根长也有同样趋势。在所有IBA水平下，蔗糖浓度15 g/L时植株株高均显著高于蔗糖浓度30 g/L的培养基。各处理植株生长均良好，综合考虑成本和效果，王氏唇柱苣苔的生根培养基可以选用1/2 MS培养基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖。各处理获得的生根苗移栽成活率在92%以上（图1-F）。

2.4 王氏唇柱苣苔组培过程形态发生组织学观察

王氏唇柱苣苔叶片外植体器官发生过程的组织切片观察结果见图2。由图2可见，接种前王氏唇柱苣苔细胞排列整齐，规则（图2-A）；接种3周后，外植体的上下表皮均可形成分生组织（图2-B，C）；第4周后分生细胞继续分裂，形成叶、芽原基，维管束与外植体相联接，故为器官发生途径（图2-E，F，G）。

2.5 染色体计数和变异性检测

随机对50株王氏唇柱苣苔组培苗的染色体压片观察表明，王氏唇柱苣苔染色体较小，在所有观察个体中，染色体均为2n=36（图3），与母本观察到的染色体数一致，表明组培并没未使其染色体数量发生改变。

利用流式细胞仪测定的王氏唇柱苣苔相对DNA含量如图4所示，RN2为内参玉米B73，其2C DNA含量为4.85 pg，通过峰值比较，王氏唇柱苣苔母本基因组大小是玉米的52.8%（图4-A），2C DNA含量为2.561 pg，基因组大小为1 235 Mb；王氏唇柱苣苔组培苗基因组大小是玉米的51.8%（图4-B），2C DNA含量为2.512 pg，基因组大小为1 212 Mb，组培苗与母本相比，基因组大小发生1.86%的减少。

3 讨论

唇柱苣苔属植物组培快繁的诱导分化阶段常用激素范围为0.1～1.0 mg/L 6-BA和0～0.2 mg/L NAA，6-BA高于1.0 mg/L 便易造成试管苗玻璃化[7]。本研究中，王氏唇柱苣苔最佳诱导激素组合为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其在诱导时间和诱导芽数目方面优于6-BA与IBA、IAA组合。在继代增殖阶段，6-BA对增殖有显著影响，NAA的影响则不显著，但是2种激素混合使用的交互作用对诱导具有显著影响。这与单座苣苔的植株再生时细胞分裂素（TDZ或6-BA）与生长素（NAA）配合使用可诱导更多不定芽的结果一致[18]。在苦苣苔科植物中，最常用的生根培养基为1/2 MS，生根激素为IBA和NAA，浓度一般为0～0.5 mg/L[7]。王氏唇柱苣苔组培苗生根比较容易，2种蔗糖浓度对根数没有显著影响；但IBA浓度的增加则显著提高了生根数量，说明王氏唇柱苣苔的生根对生长素浓度比较敏感。

愈伤组织在继代过程中会发生大量变异，长期继代的愈伤组织不仅分化能力下降，而且继代时间越长，变异越复杂，变异率越高，流式细胞术是快速鉴定是否存在变异的有效方法[19]。通过流式细胞术检测，王氏唇柱苣苔组培苗与母本相比，基因组大小发生1.86%的减少，变异系数小于5%，可认为没有发生变异[20]。通过本方法快繁得到的王氏唇柱苣苔在形态上与母本保持一致，染色体数量和形态特征也没有发生变化。总体而言，王氏唇柱苣苔组织培养快速繁殖技术可保留母本遗传性状，具有遗传稳定性。在组培过程中可进一步调整培养基配方和减少继代培养次数，减少通过愈伤组织分化產生不定芽途径，增加直接产生不定芽比例，进一步降低基因组大小的变化，提高组培过程的遗传稳定性。通过组培快繁可短时间内为王氏唇柱苣苔今后的园艺应用提供大量优质种苗，降低生产成本，进而减少园艺爱好者对野生资源的采挖，有效保护其自然生境和资源。

4 结论

通过实验建立了一套简单有效的王氏唇柱苣苔离体快速繁殖体系，以叶片为外植体时，其最佳初代诱导培养基为MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最适继代培养基为MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；最适生根培养基为1/2 MS培养基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖。所获得的组培苗在无土栽培基质中移栽驯化成活率达到92%以上，组培苗没有发生变异。

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