利用代谢组学方法分析生防菌抑菌机理模式的初步建立

李艳波 史怀

摘 要 应用9种杀菌剂来处理尖孢镰刀菌，通过HPLC/Q-TOF方法进行代谢轮廓分析。结果表明：不同菌剂处理后的尖孢镰刀菌代谢组显著差异，PCA分析可将其分为6组。将6组杀菌剂作为训练样本集，建立杀菌剂对尖孢镰刀菌抑菌机理的PLS-DA模型。以枯萎病生防菌短短芽胞杆菌为测试样本，利用该模型对其活性物质进行了抑菌机理的分析判别，发现其作用方式与嘧菌酯、氰霜唑类似，即通过抑制病原菌的呼吸作用而发挥抑菌功能，说明利用该模型判别生防菌对尖孢镰刀菌的抑菌机理是可行的。

关键词 代谢组学；杀菌剂；PLS-DA模型

中图分类号 Q946 文献标识码 A

Establishment of a Analysis Method for Antifungal Modes of

Biocontrol Strains on Cucumber Fusarium

Wilt by Metabonomics

LI Yanbo1， SHI Huai2 *

1 Department of Biotechnology， Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China

2 Agricultural Bioresources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract In this investigation， the antifungal modes of action of nine fungicide with different targets or modes-of-action on Fusarium oxysporum were studied. Metabolic profiles of cultures treated with nine different fungicide were acquired by LC/Q-TOF MS， significant metabolic markers were used for classification by PCA analysis， and the fungicide could be divided into six groups. Using the six groups as training sample set， PLS-DA prediction model were established. Confirmed with the model， the conclusion could be drawn that the antifungal mode of action of Brevibacillus brevis， a biocontrol strain of Cucumber Fusarium Wilt， is similar to that of azoxystrobin and Cyazofamid， which act as respiratory inhibitor.

Key Words metabonomic； fungicide； PLS-DA prediction model

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.027

利用環境中一些对植物病原菌具有拮抗、抑制、竞争、寄生及诱导植物抗性等作用的有益微生物及其代谢产物进行植物病害防治，是现代植物病害控制的一个重要手段[1]。然而，尽管中国在植物病害生物防治方面取得了一批研究成果，但仍存在诸多问题，尤其是许多生防菌功能物质及其作用机理尚不明确[2]。这对提高生防菌抑菌活性，充分发挥其作用，以及基于作用靶标的新药物分子生物合成设计研究造成了严重制约。

代谢组学（metabonomics）作为系统生物学的组成部分，显示的是生物系统对基因以及环境变化的最终应答，代表着“组学”层次上的结束[3]。近年来，代谢组学研究取得了长足发展，在生物、医药等领域的研究中发挥了重要的作用[4-10]。利用代谢组学研究外源物质引起的病原菌内源性代谢物变化，能更直接地了解病原菌体内生物化学过程和状态变化，从而更高效地探索外源物质作用靶标及作用机制。如Yu等[11]利用LC-MS比较了金果榄（Tinospora capillipes）提取物和已知作用机理的9种天然抗生素处理后金色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus）代谢轮廓变化，明确了提取物的作用机理类似于利福霉素（rifampicin）和诺氟沙星（norfloxacin）。易智彪[12]以金黄色葡萄球菌为靶标，建立已知抗生素的抗菌模式图，进行了4种抑菌中草药活性成分的代谢组学研究，确认桔皮黄酮提取物的抑菌机理是完全有别于现有已知机理的抗生素。这些药物作用机理的代谢组学研究主要集中于医药方面，而在农药，尤其是生物源天然活性抑菌物质的作用机理上，目前尚未见报道。

本研究采用基于HPLC/Q-TOF MS的代谢组学分析方法，以黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）为研究对象，通过分析已知杀菌剂对尖孢镰刀菌代谢组的影响，建立PLS-DA预测模型并进行验证，为进一步研究相关抑菌物质的作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 Agilent 1260/6520 Q-TOF LC/MS，配ESI电喷雾离子源；Eppendorf高速冷冻离心机；Sanyo超低温冰箱；甲醇、乙腈、乙酸铵，均为色谱纯，生产厂家为默克。供试杀菌剂原药均购自百灵威科技有限公司。

1.1.2 供试菌株 尖孢镰刀菌FJAT-9728菌株，由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 供试杀菌剂对尖孢镰刀菌的室内毒力测定

菌株活化后接种于察氏培养基（蔗糖3 g/L，NaNO3 0.3 g/L，K2HPO4 0.1 g/L，KCl 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，FeSO4 0.001 g/L，琼脂2 g）上，25 ℃培养3 d，用直径5 mm的打孔器切取菌落外缘制备成菌饼。将9种杀菌剂分别制成含0.1、1、10、100、200 μg/mL的察氏平板，以不加杀菌剂的平板为对照，每个浓度重复3次。将菌饼置于含药培养基中央，25 ℃培养3 d后测定菌落直径，以平均数代表菌落大小，计算各杀菌剂的相对抑制率、毒力回归方程、EC50值。

1.2.2 菌株培养 菌株于察氏培养基25 ℃培养7 d，用0.03%吐温80冲洗菌落，孢子悬液经灭菌的脱脂棉过滤后计数并稀释至1×106 spores/mL，取200 μL均匀涂布在分别内含各供试杀菌剂以及枯萎病生防菌短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）活性代谢产物并铺有玻璃纸的察氏培养基上，每个处理3次重复，另设空白对照，25 ℃培养7 d。杀菌剂的使用浓度根据测得的EC50值设定，短短芽胞杆菌活性代谢产物的提取参照黄素芳等[13]的方法。

1.2.3 样品制备 参照罗飞飞等[14]的方法并稍加改进：菌株培养7 d后将菌落刮入50 mL离心管，加入20 mL 0.03%吐温80涡旋3 min，经20 μm无菌滤布过滤后蒸馏水冲洗，菌丝装入5 mL离心管，液氮冷冻淬灭，冻干48 h后将菌丝粉碎。各处理分别称取10 mg冻干的菌丝，加入2 mL 80% 甲醇涡旋30 s，超声提取1 h后4 ℃静置12 h。提取物5 600 ×g离心10 min，取1.5 mL上清，0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC-MS分析。

1.2.4 液相色譜与质谱条件 色谱条件：Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱（2.1×50 mm，1.8-Micron）；进样体积10 μL；柱温35 ℃；流动相A=10 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B=乙腈，梯度洗脱程序：0～8 min 10% A，8～15 min 10%～50% A，15～30 min 50% A；30～40 min 50%～10% A，40～55 min 10% A。

质谱条件：ESI源；正离子模式；毛细管电压20 V；喷雾器压力30 psi；干燥气流量10 L/min，干燥气温度300 ℃；碰撞电压230 V；椎体孔电压65 V；质量范围100～1 000 m/z；标准质量121.050 873、922.009 798[15]。

1.3 数据分析

参照史怀等[6]的方法，原始LC-MS数据利用Agilent MassHunter工作站软件（含Qualitative Anlysis和Mass Profiler Professional模块）进行处理，包括分子特征提取（MFE）、背景扣除、数据筛选。9个杀菌剂及空白共10个处理3次重复30组数据经处理后，以检测到的代谢物及其相对丰度值为指标，以各处理为样本，构建数据矩阵进行主成分（PCA）分析，选取对代谢轮廓变化影响最大的2个PC值作得分散点图；以不同杀菌剂处理样品为训练样本集，通过PLS-DA算法建立预测模型，并将生防菌活性代谢物处理样品作为未知样品导入模型预测其杀菌机理。

2 结果与分析

2.1 供试杀菌剂对尖孢镰刀菌的室内毒力测定

室内毒力测定的结果表明，供试的9种杀菌剂对尖孢镰刀菌均有抑制作用，其毒力回归方程及EC50值见表1。

根据测定的结果，试验杀菌剂的使用浓度设置为：多抗霉素6 μg/mL、尼柯霉素8 μg/mL、腈菌唑0.25 μg/mL、氟硅唑0.3 μg/mL、甲霜灵100 μg/mL、嘧菌胺200 μg/mL、多菌灵0.12 μg/mL、嘧菌酯150 μg/mL、氰霜唑75 μg/mL。

2.2 不同杀菌剂处理后的尖孢镰刀菌代谢物

图1为部分尖孢镰刀菌样品的总离子流色谱图，其中A、B、C分别为控制样本、多抗霉素处理以及嘧菌胺处理。由图1可知，控制样本与杀菌剂处理后得到的代谢物谱图轮廓相似，其代谢物的出峰时间主要集中在0～8、14～32、38～52 min 3个时间段。每个处理的代谢物集中出现区域波谱形态与强度并不完全一致，尤其在38～52 min区间有明显差异。

2.3 不同致病性尖孢镰刀菌代谢组学PCA分析

由图2可知，各杀菌剂处理后的样本均能与对照样本清晰的区分开来，而具有相同作用机理的杀菌剂其投影聚集在一起（杀菌剂的作用模式见表2[16]）。多菌灵（●）的作用靶标是微管蛋白组，影响真菌的有丝分裂，其集群明显与其他作用方式的杀菌剂分离开来，甲霜灵（▲）和嘧菌胺（△）也是如此。而多抗霉素（■）和尼柯霉素（□）都是作用于几丁质合成酶，干扰病原菌的细胞壁生成，被聚为一组，同样，具有相同作用靶标的腈菌唑（◆）与氟硅唑（◇）也被聚集在同一组。相对于其他杀菌剂，嘧菌酯（○）和氰霜唑（×）对抑制呼吸作用位点不同，但其作用机理相似，所以腈菌唑（◆）与氟硅唑（◇）在图2中十分接近。说明尖胞镰刀菌受到杀菌剂影响后，在统计学意义上，相同或相似作用位点的杀菌剂具有相同的代谢信息，而不同作用模式的杀菌剂的代谢信息完全不同。

2.4 杀菌剂作用机理模型建立与生防菌作用机理分析

通过PCA分析得知不同作用模式的杀菌剂处理后尖胞镰刀菌的代谢行为不同，为了提高代谢组学方法鉴定未知物质抑菌机理的能力，本研究进一步利用供试杀菌剂处理后的尖胞镰刀菌代谢物构建统计学预测模型，利用该模型对未知物质进行杀菌机理的预测。将不同处理的样本按杀菌机理分为影响细胞壁合成（W）、影响细胞膜合成（M）、影响核酸合成（N）、影响氨基酸与蛋白合成（P）、干扰有丝分裂（D）以及抑制呼吸作用（R）6个组，作为训练样本集，建立基于通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）算法的预测模型。从表3的混淆矩阵中可知，训练样本集的各样品预测准确度均达到100%，表明该方法具有极高的预测能力。

以枯萎病生防菌短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）的活性代谢产物作为未知样本，导入模型中进行预测。3个重复样品的预测结果均被归类于R组，即抑制呼吸作用，其置信测度分别为0.903、0.896和0.915（表4）。

3 讨论

用9种已知抑菌机理的杀菌剂分别处理尖孢镰刀菌，采用HPLC/Q-TOF方法对尖孢镰刀菌代谢轮廓进行分析结果表明，杀菌剂处理以及空白对照组的尖孢镰刀菌代谢轮廓有显著差异，在PCA得分图中可明显区分。把不同杀菌剂处理的样品分为6种抑菌模式作为训练样本集，建立杀菌剂作用方式的PLS-DA模型，并利用该模型对枯萎病生防菌短短芽胞杆菌的活性物质进行了抑菌机理的预判结果表明，其作用方式与嘧菌酯、氰霜唑类似，即通过抑制病原菌的呼吸作用而发挥抑菌功能。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GXL菌株是福建省农业科学院农业微生物创新团队筛选到的一株高效生防菌，该菌株对作物枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌具有很好的抑制作用[17-18]。车建美等[19-20]对其抑菌功能成分进行了分析，认为活性成分是多种物质的混合物，但对尖孢镰刀菌起生防作用的主要成分为羟苯乙酯。羟苯乙酯属于尼泊金酯类防腐剂，能够破坏生物氧化过程中电子传递链的完整性，抑制病原菌的呼吸作用，从而抑制病原菌生长[21]。这与本研究通过建立杀菌剂作用机理判别模型预测的结果相符，证明该模型预测具有可行性。

通常，生防菌活性物质的发现、确定以及其作用机理的研究需要进行大量的试验，采用代谢组学的方法可以快速的对活性物质作用方式进行预判，避免了繁琐的实验步骤，为生防菌的活性物质发现及其作用机理的研究提供了一条新途径。当然，本研究选取的杀菌剂并不能完全代表所有的已知杀菌作用方式，因此建立的模型尚不完善，有待后续实验继续补充。

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