金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌性能研究

黄聪亮 邹兰 胡月英 黎智明 陈文学

摘 要 用乙醇作为溶剂，提取出金线莲中的有效抑菌物质，采用二倍稀释法确定金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（Minimal inhibition concentration， MIC）为5.000 mg/mL；并经介质pH、热处理和紫外线处理提取物，发现其抑菌圈直径在pH9.0和30 ℃下最大；分析金线莲乙醇提取物对供试菌蛋白质和还原糖的利用能力，表明金线莲乙醇提取物通过减弱蛋白质和还原糖的代谢来抑制细菌的生长繁殖。

关键词 金线莲；抑菌机理；最小抑菌浓度；稳定性

中图分类号 R284.2 文献标识码 A

Antibacterial Activity of the Ethanol Extract of Anoectochilus

roxburghii on Staphylococcus aureus

HUANG Congliang1， ZOU Lan2， HU Yueying3， LI Zhiming2，CHEN Wenxue2*

1 Department of Food and Biological Engineering， Zhangzhou Institute of Technology， Zhangzhou， Fujian 363000， China

2 College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Material and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Anoectochilus roxburghii was extracted by ethanol. The minimal inhibition concertation（MIC）was detected by the broth two-fold agar dilution method and Staphylococcus aureus MIC was 5 mg/mL. Besides， the inhibitory zone diameters of the ethanol extract on A. roxburghii was up to the maximum at pH9 and 30 ℃， respectively. The protein and sugar concentrations in the bacterium were determined， and the results showed that the ethanol extract of A. roxburghii could inhibit the metabolism of the two substances， which affected the growing of the bacterium.

Key words Anoectochilus roxburghii； antibacterial activity； MIC（minimal inhibition concentration）； antibacterial stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.026

中藥材金线莲为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus BL）多年生地生草本植物，一般认为包括2种原植物，一种是金线兰[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl.]，又名花叶开唇兰，另一种是台湾银线兰（Anoectochilus formosanus Hayata），又名金线莲。金线莲在中国主要分布于亚热带地区，即福建、广东、广西、浙江、江西、海南、云南、四川、贵州以及西藏南部等省区[1-2]，其中以闽、浙、赣为主产地，台湾省亦产，但植物种不同，为台湾开唇金线莲是中国传统的珍贵药材，全草均可入药，在民间治疗范围较广，素有“药王”、“神药”的美称[3]。其味甘微苦，性平微寒，具有非常强的药用价值，其不仅能降血压、解毒、止痛、镇咳，且在民间还被用于治疗支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎等疾病，均有很好疗效[4-5]。研究发现，金线莲中主要活性成分是生物碱、糖类、有机酸、黄酮类化合物、苷类化合物、甾体类和挥发油类化合物[6-9]。其中，黄酮类化合物中含有的槲皮素以及有机酸中的阿魏酸、绿原酸等成分被证明与抗菌活性有关[10-11]。然而，目前大多研究仅针对金线莲的栽培及组织培养，或是针对其中的成分进行分析、提纯和分离，而对其在微生物方面的抑制作用及抑菌机理方面的研究较少。笔者以金黄色葡萄球菌作为目标菌，研究金线莲乙醇提取物对供试菌的抑菌作用，并对其抑菌机理进行初步研究，为其在食品防腐保鲜中的应用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

金线莲，试验所用细菌为金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，（ATCC6538）]均由海南大学食品学院微生物实验室提供。乙醇试剂均购自天津市富宇精细化工有限公司，均为分析纯；牛肉膏、琼脂均购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨购自广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖购自广州化学试剂厂；牛血清蛋白和考马斯亮蓝G-250购于sigma公司；蒽酮购于国药集团化学试剂公司。

FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；WF-300EH型超声清洗机（宁波海曙五方超声设备有限公司）；RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ZHWY-211B型恒温培养振荡箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；SW-CJ-1FD型洁净工作台（苏州佳宝净化工程有限公司）；722型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 金线莲的提取 将金线莲干燥并粉碎后，按料液比1 ∶ 10（g ∶ mL），用80%（V/V）乙醇浸泡120 min，抽滤后，用旋转蒸发仪蒸出溶剂，而后用50 ℃水浴锅蒸干，置4 ℃冰箱备用。

1.2.2 菌种的活化及培养 （1）菌种活化：将金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨培养基中活化后保存备用。采用麦氏比浊法[12]，用NaCl（0.9%）将培养后的细菌从斜面上洗脱下来，并将菌悬液的浓度稀释至含菌量约为106～107 cfu/mL，用于金线莲乙醇提取物最小抑菌浓度的测定和其抗菌稳定性的测定。

（2）菌种培养：取1 mL的上述菌悬液，置49 mL的液体培养基中。将得到的金线莲乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培养作为试验组，最终液体中提取物的浓度为MIC值；对照组中加入与金线莲乙醇提取物相同体积的乙醇。各组均在摇床培养箱中进行培养，温度为37 ℃，转速为130 r/min，培养时间为24 h。

1.2.3 金线莲乙醇提取物MIC的测定 准确称取2.0 g金线莲的乙醇提取物，用10 mL的80%乙醇将其溶解，配制成200 mg/mL的原液。用试管二倍递减稀释法[13]，将提取物原液稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL样品液。以金黄色葡萄球菌为供试菌，进行各提取物MIC的测定[14]。

每个平板分别加入上述配制好的7个浓度样品液1 mL，与9 mL降温至45 ℃左右的无菌固体培养基混合均匀，配制成浓度为20.00、10.00、5.000、2.500、1.250、0.625 0、0.312 5 mg/mL的含药平板，待培养基凝固后吸取100 μL浓度为107～108 cfu/mL的菌悬液加于培养基上，均匀涂布。每个浓度做3次重复，同时做乙醇和无菌水的空白对照。将各平板于37 ℃培养箱中培养24 h，取出观察结果，以完全不长菌的最小稀释浓度为该金线莲提取物的MIC。若含药平板的培养基上有肉眼不易识别的菌体生长，可从该板中取一环接种于新的固体平板上，培养24 h后进行观察。

1.2.4 金线莲乙醇提取物抑菌稳定性的研究 考察提取物对热和紫外线处理的稳定性，以便为金线莲乙醇提取物的应用提供理论依据。采用滤纸片法[15]，取吸水力较强且质地均匀的滤纸，用打孔器打成直径6 mm的圆形滤纸片，置洁净干燥的培养皿中，干热灭菌后备用。于超净工作台中，待固体培养基温度为40 ℃时，在每个无菌平板中加入100 μL浓度106～107 cfu/mL的菌悬液，并使菌液均匀的分散在培养基上，制成含菌平板，分别测定pH、温度和紫外照射时间对金线莲乙醇提取物抑菌效果的影响，抑菌效果的强弱用抑菌圈直径来表示[16]。抑菌圈直径=抑菌直径-滤纸片纸直径。

（1）介质pH值对金线莲乙醇提取物抑菌活性的影响：分别用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液调节培养液的pH值，将各菌种最小抑菌浓度下的金线莲乙醇提取物制成pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培养液，用灭菌后的滤纸片分别浸没于不同pH的提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，于培养箱中培养24 h后，测定金线莲乙醇提取物的抑菌圈直径。

（2）加热处理对金线莲乙醇提取物抑菌活性的影响：将各试验菌对应最小抑菌浓度下的80%金线莲乙醇提取物分别在不同温度（在30～100 ℃中，选取5个温度）条件下，热处理30 min后，将灭菌滤纸片分别浸没于提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，每个处理条件做 3次重复，并测定金线莲乙醇提取物的抑菌圈直径。

（3）紫外线对金线莲乙醇提取物抑菌活性的影响：将各试验菌对应最小抑菌浓度下的80%金线莲乙醇提取物在紫外灯下进行不同时长的照射，将滤纸片分别在不同时长紫外照射处理过的提取物中浸泡24 h。然后放在含菌平板上，每个处理3次重复，分别测定金线莲乙醇提取物的抑菌圈直径。

1.2.5 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法测定供试菌蛋白质含量的变化[17-18]。取1 mL的上述菌悬液，置于49 mL的液体培养基中。将得到的金线莲乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培养作为试验组，最终液体中提取物的浓度为MIC值；对照组中加入与金线莲乙醇提取物相同体积的乙醇。各组均在摇床培养箱中进行培养，温度为37 ℃，转速为130 r/min，培养时间为24 h。分别于0、4、8、12、24 h取样后，于6 000 r/min，4 ℃下离心15 min。取上清液于595 nm下检测蛋白质含量。

1.2.6 还原糖含量的测定 按照1.2.5方法培养后，取培养后的菌液，于6 000 r/min，4 ℃下离心15 min。采用蒽酮比色法[19]，取上清液于620 nm下测定各管的吸光度值，并以标准曲线为对照，计算经金线莲乙醇提取物处理后供试菌还原糖含量的变化。

1.3 数据分析

采用SAS8.2统计软件对数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同供试菌金线莲乙醇提取物的MIC

采用2倍稀释法，测定提取物对不同供试菌的MIC，结果见表1。

由表1可见，金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌有較强的抑菌作用。金线莲乙醇提取物金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5.000 mg/mL，可见金线莲乙醇提取物在较低浓度下对金黄色葡萄球菌有较明显的抑制作用。

2.2 金线莲乙醇提取物稳定性的测定

2.2.1 介质pH值对金线莲乙醇提取物抑菌活性的影响 图1为不同pH条件下，金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。由图1可看出，提取物在不同pH下对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不同，且随着pH的增大，抑菌圈直径逐渐增大，其中pH9.0时抑菌效果最好，抑菌圈直径达到12.50 mm。通过显著性分析可知，在5%的显著水平下随着pH的变化，金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用存在显著性差异，金线莲提取物在碱性条件下抑菌效果要优于酸性条件。

2.2.2 热处理对金线莲乙醇提取物抑菌活性的影响

由图2可以看出，随着处理温度的升高，提取物抑菌圈直径逐渐减小，其中，30 ℃时，抑菌圈直径最大。通过分析可知，在5%显著水平下，随着处理温度的变化，金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用差异显著，金线莲提取物在低温下抑菌效果更明显。

2.2.3 紫外线对金线莲乙醇提物抑菌活性的影响

由图3可以看出，随着照射时长的增加，抑菌圈直径有微弱的减小。通过显著性分析（p<0.05），不同紫外线照射时间并不会对提取物抑菌活性造成较大影响，差异不显著。

综上分析，金线莲乙醇提取物受到pH值和温度的影响较为显著，紫外照射时间对其影响效果不明显，且其在碱性条件和低温下，抑菌效果最好。

2.3 蛋白质含量

图4为蛋白质标准曲线，图5为金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌利用蛋白质的影响。由图5可知，尽管供试菌的对照组和试验组中蛋白质含量均呈现先上升后下降，但对照组菌液蛋白质浓度显著低于实验组。

2.4 还原糖含量

图6为还原糖标准曲线，图7为金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌还原糖吸收利用能力的影响。由图7可知，金黄色葡萄球菌2个处理组的还原糖含量均出现下降趋势。

3 讨论

本文分析了金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC和抑菌稳定性等抑菌性能，同时还测定了供试菌内蛋白质和还原糖的变化情况，揭示了其机理。结果表明：金线莲乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为5.000 mg/mL；而杨敏等[20]研究了胡椒乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为40.00 mg/mL。这说明金线莲乙醇提取物在较小的浓度下就能抑制细菌的生长。金线莲乙醇提取物的抑菌稳定性试验表明：分别在pH9和30 ℃时，抑菌圈直径最大，提抑菌能力最强；金线莲提取物抑菌效果受pH和温度的影响，对紫外照射时间不敏感[21]，这可能是不同物质的提取物，这3个因素对其的作用机理不同。蛋白质和还原糖是生物体内基础的能量物质，它们通过代谢可为生物体提供物质和能量来源。本研究发现金线莲乙醇提取物降低了金黄色葡萄球菌还原糖和蛋白质的利用率，说明金线莲乙醇提取物抑制通过降低还原糖和蛋白质的利用率来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。彭美芳等[22]也研究了草果提取物对金黄色葡萄球菌的蛋白质的含量的影响，发现其能显著降低蛋白质的消耗量，与本试验的研究结果一致。这可能是金线莲乙醇提取物影响了细胞膜的通透性所致。细胞膜通透性增加，既影响菌体对蛋白质和还原糖的吸收，同时还会使蛋白质和还原糖大量外泄[22]；同时，由于存活的金黄色葡萄球菌仍进行呼吸作用消耗了部分还原糖和蛋白质，致使其含量降低[23]。此外，还有可能是金线莲乙醇提取物影响了供试菌内蛋白质的表达，从而抑制了菌体的生长[24]。因此，酸碱度及温度能影响金线莲乙醇提取物的抑菌强弱；且经初步分析，其主要是通过抑制菌体内蛋白质和还原糖的代谢来抑制细胞的生长。

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