内蒙古化德县贮期通风库内马铃薯腐烂的病原鉴定

张凯 王希卓 孙洁 杨琴 孙海亭

摘要[目的]明確内蒙古贮期马铃薯主要贮藏病害种类。[方法]2015年10月至2016年4月在内蒙古乌兰察布市化德县对贮期通风库内腐烂的马铃薯进行取样，采用组织分离法对病原菌进行分离、纯化培养以及形态观察与分子鉴定。[结果]造成化德县贮期马铃薯腐烂的病害有干腐病（Fusarium spp.）、晚疫病（Phytophthora infestans）、早疫病（Althernaria solani）、环腐病（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus）、软腐病（Erwnia spp.），其中，干腐病为主要病害。经鉴定，引起马铃薯干腐病的病原菌有4种：接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麦镰刀菌（Fusarium Link）、锐顶镰孢（Fusarium acuminatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）。致病疫霉引起的晚疫病及部分茄链格孢引起的早疫病易发生复合侵染，多出现在腐烂较严重的薯块，贮藏后期病薯多存在真菌复合侵染现象，腐烂严重薯块还存在细菌复合侵染现象。[结论]试验结果为马铃薯贮期防病提供了理论依据。

关键词马铃薯；贮期病害；病原鉴定；CTAB法；PCR扩增；分子鉴定

中图分类号S509.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）10-0147-05

Identification of Pathogen of Potato Rot Disease Inner Ventilation Bank of Huade County， Mongolia during Storage Period

ZHANG Kai， WANG Xizhuo， SUN Jie et al（Chinese Academy of Agricultural Engineering，key Laboratory of Agricultural Products Postpartum Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100125）

Abstract [Objective] The aim was to clear main pathogen of potato rot disease inner ventilation bank of Huade County， Mongolia during storage period. [Method] We sampled rotten potato during the storage period from October， 2015 to April， 2016 inner ventilation bank of Huade County， Wulanchabu City， Mongolia， used organizational separation method to separate and culture pathogens， and defined through the means of morphology and molecular identification. [Result] There were several diseases to cause potato rot disease during the storage period in Huade County， such as dry rot disease（Fusarium spp.）， late blight disease（Phytophthora infestans）， early blight disease（Althernaria solani），ring rot disease（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus） and rot disease（Erwnia spp.）， among them the dry rot disease was the main disease. There were 4 kinds of pathogens cause dry rot disease of potato through the identification， such as Fusarium sambucinum，Fusarium Link，Fusarium acuminatum and Fusarium equiseti. The late blight disease caused by Phytophthora infestans and early blight disease caused by part Alternaria solani were often happened in much serious rot potatoes which occurred mixed infection， and these potatoes were always infected by variety of fungi in the late period of storage， the severe rotting potatoes were occurred complex infection by bacterium. [Conclusion] The results provide theoretical basis for disease control of potato during storage period.

Key wordsPotato；Storage diseases；Identification of the pathogen；The CTAB method；PCR amplification；Molecular identification

马铃薯由于具有适应范围广、抗逆性强、单产水平高、粮菜兼用、营养丰富、节水节地等优势，近年来越来越受重视，种植面积与产量也连年增加。尤其在2015年余欣荣副部长发表了关于我国“马铃薯主粮化”战略的谈话之后，可预见今后几年我国的马铃薯产量仍会保持较高的增长速度。随着马铃薯产业的不断发展，鲜薯的贮藏量不断扩大，贮藏周期进一步延长，贮藏病害造成的腐烂问题也日渐突出。据统计，病害造成的产后马铃薯损失普遍在10%以上[1-3]，由于贮藏管理不规范等原因，部分地区马铃薯产后损失更是高达20%～30%[2]，甚至达50%造成烂窖[3]。笔者对贮期马铃薯病害病原进行了鉴定，明确内蒙古地区贮期马铃薯主要贮藏病害种类，以期为马铃薯贮期防病提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料调查地点为内蒙古乌兰察布市化德县。调查品种为当地种植面积较广的夏波蒂。

1.2调查方法分别于马铃薯贮藏中期（2016年2月）与贮藏后期（2016年4月）分2批通过随机取样的方式对病薯进行了取样。第1批调查病薯送样3个（以F开头命名，薯块以阿拉伯数字顺序编号，如F1表示第1批的第1个薯块）；第2批病薯送样19个（以S开头命名，薯块以阿拉伯数字顺序编号，如S1代表第2批中的第1個薯块）。

1.3病原菌的分离与鉴定

1.3.1分离与纯化。采用组织分离法[4-5]对马铃薯病原菌进行分离。先将病薯用75%乙醇表面消毒，然后将薯块切开，用解剖刀切取病健交界处2～3 mm的小块，每个薯块不同病斑取10块，转至PDA培养基中，在25 ℃培养箱中黑暗培养，然后挑取边缘菌丝进行纯化。

1.3.2形态鉴定。主要依据Booth镰刀菌分类系统的标准[6-7]，同时参考王拱辰等[8]关于镰刀菌的鉴定方法进行补充。具体鉴定指标：培养物色泽及菌落形态；PSA上培养7 d，孢子的类型、着生方式、形态及大小（测量30个以上孢子长宽）；产孢细胞的类型及形态。

1.3.3分子鉴定。选取5株分离物。采用改进的CTAB法[9]提取其基因组DNA。用1.0%琼脂糖凝胶检测DNA的质量及浓度。利用ITS4和ITS5引物对进行PCR扩增[10]。反应体系：ES PCR Master Mix 12.5 μL，ITS5 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.0 μL。扩增程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测后送上海生工生物工程有限公司测序。将测定ITS序列在GenBank中进行Blast比对[11-12]，根据其相似度确定测定序列的种类。

2结果与分析

2.1送检病薯的症状观察

第1批所送的3个薯块，2个腐烂严重，腐烂部分可达整薯的80%以上，薯块表皮已长出浓密的白色或略带红色的菌丝（图1-A，1和2），1块腐烂程度较轻，表皮上有直径1.5～2.0 cm的凹陷、深褐色、坚硬坏死斑（图1-A，3）。严重腐烂的2个薯块切开后，内部薯肉出现褐色至黑色的组织坏死（图1-B和1-C），出现或部分出现了由组织崩解造成的空腔，空腔内产生了大量病菌霉层（图1-B）。发病轻的薯块切开后，薯肉除表皮腐烂对应部位有很薄的黑色坏死外，其余部分仍保持健康（图1-D），这主要是由于薯块在初期侵染后，由于外界条件，包括贮藏条件的变化，使得病害发展停滞。

第2批样品共计19个薯块，其中3个运回实验室的过程中发生腐烂，如图2-D；其余16个薯块大多为轻微的坏死（图2-A）。薯块切开后多数薯肉颜色正常，仅坏死斑下部有坏死组织（图2-B），个别薯块切开呈湿腐状（图2-C）。

2.2病原物的分离、鉴定和病害诊断

2.2.1第1批样品病原物的分离、鉴定和病害诊断。

从第1批样品（F1、F2和F3）中，每个薯块分离了10个标样，其中F1薯块上分离到了4个菌株，而F2和F3分别分离出3个菌株，共计分离获得10个菌株（表1）。通过形态学观察，该批所分离的10个菌株分别为接骨木镰刀菌6株、锐顶镰刀菌2株、致病疫霉和茄链格孢各1株。

2.2.2第2批样品病原菌的分离、鉴定和病害诊断。从第2批样品（S1～S19）中，每个薯块分离了10个标样，共计分离获得27株菌。其中，薯块S6和S9上各分离到4株菌，S1、S4和S7薯块上各分离到3株菌，S5和S10薯块上各分离到2株菌，剩下的S2、S8、S11、S12、S14、S19上各分离到1株菌（表2）。通过形态学观察和抽样分子鉴定，该批所分离的27株菌中，引起干腐病的4种镰刀菌共计21株，包括8株锐顶镰刀菌、6株木贼镰刀菌、5株燕麦镰刀菌和2株接骨木镰刀菌，而剩余6株菌中有3株为引起晚疫病的致病疫霉，其他3株分别为引起早疫病的茄链格孢、引起环腐病的密执安棒形菌和引起软腐病的胡萝卜欧文氏菌。

根据观察干腐病病原菌共有以下4种：

（1）接骨木镰刀菌。PSA培养基上气生菌丝稀疏，丛卷毛状，初呈白色，后变淡黄色或玫瑰色（图3-A）。产孢细胞单瓶梗，瓶状小梗呈圆柱形、倒棍棒形，大小为11.03～25.61 μm×2.24～3.88 μm（图3-B）。分生孢子散生其间，并在培养基表面形成大量粉状孢子堆。大型分生孢子弯曲，近似纺锤形，背腹分明，顶部细胞鸟嘴形，基胞足跟明显或不明显，通常具3～5个分隔，孢子大小为19.29～40.21 μm×4.49～7.63 μm（图3-C）。小型分生孢子和厚垣孢子未观察到。

（2）锐顶镰刀菌。在PSA上气生菌丝棉絮状，表面玫瑰红色，边缘白色，中心部分变为黄棕色，底部为红棕色（图4-A）。PSA上不易产孢，Bilay培养基上气生菌丝稀疏，白色。大型分生孢子镰刀型，背腹面弯曲，多数3～5个分隔，大小为25.11～48.77 μm×3.02～4.08 μm（图4-B）。小型分生孢子几乎没有。产孢细胞单瓶梗多分枝，倒棍棒状，大小为27.69～40.36 μm×3.47～4.38 μm（图4-C）。

（3）燕麦镰孢。PSA上气生菌丝绒状至棉絮状，白色，后夹有土黄色（图5-A），大型分生孢子鳗鱼形，细长，略弯两端渐尖，3～8个分隔，多数5隔，大小34.00～80.00 μm×3.50～4.00 μm（图5-C），菌丝细长，无隔，有二叉分支（图5-B）。

（4）木贼镰孢。PSA上气生菌丝绒状至棉絮状，底部浅驼色，可长橘黄色分生孢子座，基物表面黄色至淡褐色，基物不变色（图6-A）。大型分生孢子镰刀形，弯曲，中部细胞膨大，顶胞延长呈锥形，基胞有足跟，3～5个分隔，大小16.50～81.00 μm×3.00～6.00 μm（图6-C），菌丝分枝较多，不分隔（图6-B）。

同一薯块上可分离到多种病原菌，如第2批编号为S6的薯块上，分离获得3种镰刀菌，即锐顶镰孢（图7，S6-1）、燕麦镰孢（图7，S6-3）和木贼镰孢（图7，S6-4），还分离出1株茄链隔孢（图7，S6-2），表明该薯块是由3种镰刀菌引起的干腐病和早疫病的复合侵染。

为了进一步验证形态学鉴定，从所分离的菌株中选择了S9-1、S1-3、S14、S5-2、S8等菌株测定其ITS序列，在GenBank中进行Blast[11-12]搜索比对，其结果与形态学鉴定一致。

3结论与讨论

通过对样品马铃薯进行病害诊断，内蒙古化德地区贮期的主要病害有5种，其中马铃薯干腐病（Fusarium spp.）为2015年当地贮期最主要病害，病害轻微发病造成薯块表皮褐斑，影响经济及种用价值，严重发病造成薯块凹陷腐烂，失去应有价值；马铃薯晚疫病和马铃薯早疫病发病比例不高，但病害多为后期侵染复合发病，呼吸增强，温度升高加速了薯块的腐烂过程[13]，对薯块造成致命性破坏，复合发病的薯块多失去商用价值，且病残体极易成为次年贮期病害的初侵染源；马铃薯环腐病（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus）病害自块茎内部发病，轻微发病无明显症状，待到发现薯块萎蔫、芽眼黑枯之后切开一般可见维管束呈乳白色或黄褐色环状腐烂[3]，此时马铃薯已失去价值，因此对环腐病更应做好预防工作；软腐病（Erwnia spp.）发病率较低，其他损伤所占比例较高。

研究表明，马铃薯贮藏病害除了上述种类以外，还包括马铃薯黑胫病（Erwinia carotovora subsp.atroseptica）、马铃薯茎线虫病（Ditylenchus destructor）、马铃薯疮痂病（Streptomyces scabies）、马铃薯黑心病（生理性病害）等[14]，该次调查未发现这几种病害，关于内蒙地区马铃薯储藏期是否还有其他病害有待进一步调查鉴定。通过对采集病薯样品进行病原菌的分离鉴定，共鉴定出8种病原菌，分别为晚疫病病原菌致病疫霉菌（Phytophthora infestans）、早疫病病原茄链格孢（Alternaria solani）、细菌性病害环腐病病原密执安棒形菌环腐亚种（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum）、软腐病病原菌胡萝卜欧文氏菌胡萝卜致病变种（Erwiniactortovora var. carotovora）。干腐病病原菌有接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麦镰刀菌（Fusarium Link）、锐顶镰孢（Fusarium acuminatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）。

参考文献

[1]

陈彦云.宁夏西吉县马铃薯贮藏期病害调查及药劑防治研究[J].耕作与栽培，2007（3）：15-16.

[2] 石立航，胡俊，蒙美莲，等.华北地区马铃薯贮藏病害种类调查及病原菌鉴定[J]. 内蒙古农业大学学报，2010，31（4）：53-57.

[3] 赵生山，牛乐华.马铃薯贮藏期病害调查及药剂防治研究[J].植物保护，2008（11）：44-45.

[4] 刘小莉，周剑忠，黄开红，等.古银杏内生真菌的分离及其抑菌活性[J].微生物学通报，2009，36（10）：1513-1518.

[5] 王卓仁.组织分离法在食用菌选择育种中的原则与实践[J].中国食用菌，2008，27（4）：12-13.

[6] BOOTH C.The Genus Fusarium[M].Kew，Surrey：Commonwealth Mycological Institute，1971.

[7] 罗文富，李美堂，杨南町.胡卢巴及其他药材植物病原镰刀菌鉴定[J].云南农业大学学报，1992，7（3）：181-183.

[8] 王拱辰，陈辉珍.促进镰刀菌产孢的培养基[J].植物病理学报，1994，25（2）：165-166.

[9] 闫苗苗，魏光成，潘效红，等.一种适用于动物与植物总DNA提取的方法：改良CTAB法[J].安徽农业科学，2008，36（24）：10362，10373.

[10] 隋心，冯富娟，娄鑫，等.土壤微生物总DNA的提取以及土壤真菌ITS-PCR体系的建立[J].China brewing，2011，30（9）：166-168.

[11] 丁六松，张宇伟.BLAST序列比对与生物医学文献检索[J].情报检索，2003，22（4）：74-75.

[12] 胡德华.BLAST序列类似性检索策略研究[D].长沙：中南大学，2001：81.

[13] 陈爱昌，张杰，骆得功.马铃薯贮藏期腐烂原因及防治对策[J].中国马铃薯，2010，24（2）：112-113.

[14] 董金皋.农业植物病理学[M].北京：中国农业出版社，2001：154-155.

本刊提示

参考文献只列主要的、公开发表的文献，序号按文中出现先后编排。著录格式（含标点）如下：（1）期刊——作者（不超过3人者全部写出，超过者只写前3位，后加“等”）.文章题名[J].期刊名，年份，卷（期）：起止页码.（2）图书——编著者.书名[M].版次（第一版不写）.出版地：出版者，出版年：起止页码.（3）论文集——析出文献作者.题名[C]//.主编.论文集名.出版地：出版者，出版年：起止页码。