美国红枫组织培养研究进展

王婷婷

摘要根据国内外关于美国红枫组织培养的研究，以及实际生产中的经验系统阐述了美国红枫组织培养体系建立的具体过程及研究进展，并提出了存在的问题及展望，为美国红枫的大批量组培苗商业生产提供基础资料。

关键词美国红枫；组织培养；组培苗

中图分类号S723.1+32.6文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0121-02

AbstractAccording to correlational research about tissue culture of Acer rubrum L. and experience in actual production，the specific process and research progress of tissue culture system were described systematically.It also put forward the existing problems and prospect to lay the foundation for the large quantities of A. rubrum L. seedlings commercial production.

Key wordsAcer rubrum L.；Tissue culture；Tissue culture seedling

美国红枫（Acer rubrum L.）又名红花槭，为槭树科（Aceraceae）槭属（Acer Linn.）一种重要的彩色观叶类落叶乔木。美国红枫的木材纤维非常短，做成的纸浆粗糙度适宜，是一种重要的造纸类木材[1]。美国红枫生长速度快，每年达0.6～1.0 m，寿命可达100年[2]。自十几年前引进我国以来，其以优良的性状以及广泛的适应性迅速在我国苗木市场占有一席之地。

美国红枫传统的繁殖方法主要有播种、扦插以及嫁接，但是相较于传统的繁殖方法来说，组织培养可以在短期内获得大批量的优质种苗，同时可以保持原有品种的优良性状。国外对于美国红枫组培体系建立的研究比较早，最早为1986年Welsh对于美国红枫品种‘Red Sunset的研究。美国红枫引入我国的时间不是很长，国内学者对其研究相对较晚，集中在2005年以后，主要是利用带芽茎段作为外植体，通过腋芽萌发的方式建立组培体系，也有部分学者利用愈伤组织途径进行扩繁。笔者通过概述美国红枫组织培养各个阶段关键技术的研究进展，以期为美国红枫的大规模生产提供基础资料。

1腋芽萌发方式

1.1外植体采集和消毒美国红枫组培体系中最常用的外植体为带芽茎段。带芽茎段的类型以及取材时间对于消毒成功率影响很大。最容易消毒的外植体为当年的实生苗，但是考虑到当年实生苗萌芽时间长以及萌芽率较低，综合各因素考虑，选择半木质化茎段作为美国红枫腋芽萌发的外植体最为合适[3]。另外，外植体消毒的难易程度也容易受到季节的影响，春季取材消毒效果最好[4]。

美国红枫茎段外植体消毒通常先使用70%～75%乙醇浸润20～30 s[5]。之后使用无菌水冲洗3～4次，使用次氯酸钠或者0.1%升汞溶液进行后续消毒。当使用次氯酸钠溶液作为消毒试剂时，采用2%次氯酸钠5～10 min或者1%次氯酸钠溶液4 min最为适宜；当使用0.1%升汞溶液作为消毒试剂时，最适宜的消毒时间为1～2 min，污染率为36.7%～433%。经过短时间的升汞溶液消毒新芽能够正常生长，但长时间的消毒处理会导致腋芽不易抽芽，新芽畸形。笔者在实际生产中发现，相对于升汞而言，次氯酸钠的消毒效果更加稳定，且对于后续的腋芽萌发影响较小。当使用红枫的幼嫩茎段作为外植体时，利用2%次氯酸钠溶液消毒15 min可以获得最佳的消毒效果。

1.2外植体萌发

1.2.1外植体褐化。在对美国红枫茎段进行萌芽培养时发现，外植体普遍容易褐化。外植体褐化程度通常与品种特性以及所用外植体老嫩程度有关，改良美国红枫的褐化率要明显低于美国红枫，嫩枝的褐化率要低于硬枝茎段。

在培养基中添加防褐化物质以及在培养初期将外植体连续转移至新鲜培养基会显著减轻外植体的褐化情况。研究表明，用200 mg/L的VC与PVP处理外植体之后，褐化率明显降低；在培养基中添加0.4%的活性炭，可降低褐化程度，但对抑制细菌污染没有效果[6]；在培养基中分别加入1 g/L活性炭、10 mg/L硝酸银、1 g/L PVP的处理，均对褐化有所抑制，但是如果在外植体培养初期每隔2 d转移至新鲜培养基中，2～3次以后就可彻底去除褐化现象。

在实际生产中发现，在培养初期将外植体避光培养7 d左右，且调低培养室的温度至20 ℃可以明显降低褐化率。在培养基中添加0.5g/L的活性炭同样有较好的改善效果，但是要注意的是由于活性炭對培养基中的激素有一定的吸附作用，在添加活性炭的同时要适当调高培养基中的激素浓度。

1.2.2萌芽培养基配方。美国红枫外植体消毒成功之后需要在合适的萌芽培养基上进行腋芽的诱导培养。一般在进行美国红枫外植体萌发时所用的基础培养基为WPM、MS以及DKW，搭配使用细胞分裂素6-BA、TDZ、ZT和生长素IBA、NAA进行腋芽的诱导。

李源等[7]采用L16（45）正交试验，结果显示以WPM作为基础培养基添加0.5 mg/L的IBA和2.0 mg/L的6-BA，萌芽率最高。罗焕荣[8]研究得到相似的结果。

宗树斌[9]采用正交试验得出，MS培养基最有利于腋芽的萌发，最佳的培养基组合为MS+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.4 mg/L。利用6-BA、TDZ和IBA诱导腋芽萌发，结果显示单独以6-BA作为细胞分裂素，无菌芽并不分化，MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.1～0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L为最适的诱导培养基。也有一些研究使用DKW作为基础培养基，所用的萌芽培养基配方为DKW+TDZ 0.01～0.03 mg/L+6-BA 0.015～0.025 mg/L+AC 0.4～0.8 g/L[10]。

在实际生产中发现，MS培养基优于WPM和DKW培养基。在WPM培养基中培养的组培苗瘦弱、生长势缓慢，可能是与WPM 培养基中较低的离子浓度有关。在诱导培养基中添加0.01 mg/L的TDZ作为细胞分裂素，同时添加0.2～0.5 mg/L 6-BA可以明显提高腋芽的萌动比率。

1.3增殖培养增殖培养也叫继代培养，是组培苗扩大繁殖的重要步骤。培养基中激素的类型、浓度、比例是影响增殖效果的主要因素。

对于美国红枫增殖培养基配方的研究主要集中在不同细胞分裂素和生长素的搭配使用上。TDZ作为一种新型的高效细胞分裂素，在木本类植物上应用广泛，尤其在槭树科植物组培应用上非常广泛[11]。

在对美国红枫增殖培养的研究中发现MS+6-BA 0.2 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.2 mg/L为最适宜的增殖培养基，当TDZ浓度高于0.05 mg/L时，组培苗玻璃化率大于50%。研究表明，0.001 mg/L的TDZ和0.4 mg/L的NAA组合培养基更适于美国红枫组培苗的增殖，将组培苗放在MS+TDZ 0.005 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培养基中，30 d继代1次，增殖倍率可以达3.8倍。

笔者在红枫组培苗实际研发生产过程中同样发现，TDZ作为细胞分裂素对于红枫苗的组培增殖作用最为关键。单独使用BA作为细胞分裂素时，很低的浓度就会造成愈伤组织大量生长以及植物玻璃化。而搭配使用低浓度的TDZ时，增殖出的小苗长势旺盛，玻璃化概率大为降低。

1.4生根培养 美国红枫组培苗生根相对简单，在没有添加生长素的培养基中都可以生根，但在添加有IBA和NAA的培养基中，生根率高于空白培养基。一般美国红枫组培苗生根培养基中所添加的生长素为IBA，浓度为1～2 mg/L。在生根培养基中添加1～2 mg/L NAA，可以改善生根质量，提高组培苗的移栽成活率。美国红枫生根所用的基础培养基一般为MS、1/2MS以及WPM培养基，同时添加活性炭的生根培养基可以促进组培苗生根，添加的最适宜浓度为1 mg/L。

2愈伤组织途径

愈伤组织诱导途径属于器官的间接发生方式，通过愈伤组织发生方式进行增殖可以得到更高的增殖倍率，同时变异系数高，容易选育出新的品种。在基因育种领域，愈伤组织对于遗传转化体系建立具有重要的作用。

2.1外植体的选择 美国红枫愈伤组织诱导所选用的外植体类型主要有嫩茎段、叶片以及种胚。嫩茎段在接入培养基中7 d左右出现粉红色致密愈伤，同时愈伤组织生长较快、质量较好。叶片在接种后9～10 d出现嫩绿稍带红色的疏松愈伤。相比而言，茎段更适宜作为愈伤组织诱导的外植体。

2.2愈伤诱导及增殖培养基以美国红枫茎段作为外植体时，愈伤组织非常容易进行诱导生长，而且美国红枫的愈伤组织诱导一般需要使用较高浓度的细胞分裂素搭配使用生长素进行。王振龙等通过种胚诱导愈伤试验发现，培养基中低浓度的无机盐离子更有利于愈伤组织的诱导，因此选用1/2MS作为基础培养基[12]。宗树斌[9]利用正交试验得出最适宜的愈伤组织诱导培养基为 WAP+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.3 mg/L。于传[4]认为美国红枫愈伤组织诱导最佳方案为选择茎段作为外植体，并放在WPM+NAA 0.7 mg/L+KT 0.6 mg/L+BA 0.4 mg/L培养基上。同时应注意的是，美国红枫愈伤组织的诱导需要光照，暗培养下的愈伤组织虽有少许可以增殖，但部分死亡。

初代培养中的愈伤组织一般需要在生长30 d后转入增殖培养基中进行继代培养，所用的增殖培养基和诱导培养基相似。但是愈伤组织在继代3次后很容易发生褐化而死亡，这可能与美国红枫的基因型有关。

2.3愈伤分化在植物组织培养愈伤再生途径中，愈伤组织的分化是建立组培体系的重要步骤之一，只有愈伤组织可以分化为芽，组培苗才得以进一步扩繁。但是笔者在进行美国红枫愈伤组织分化试验中，大部分结果显示愈伤组织量不断增大，但均未能分化诱导出芽。

如上所述，美国红枫经过愈伤组织分化阶段进行间接再生时，技术难度较高，主要困难在于愈伤组织分化成芽的能力较弱，需要进一步研究。

3存在问题和展望

美国红枫茎段汁液丰富，在组织培养过程中极易褐化，如需大量的工厂化生产，仍需探索更好的防止褐化的标准化流程。同时，随着继代次数的增加，美国红枫组培苗很容易出现玻璃化以及品种退化的现象，在大规模生产中，需要通过长期多代的试验来确定稳定的培养基配方。通过愈伤组织再生途径很容易产生品种变异，是一种很好的新品种选育方式，目前的技术并不能使愈伤组织有效地分化为不定芽。因此，应加大此方面的科研力度。

目前市场上存在的美国红枫变种有很多，而大多数研究仅是针对美国红枫的原始种。不同变种的美国红枫组织培养流程差异较大，在对美国红枫组织培养进行后续研究时，需要针对不同的品种进行研究。同时，为了满足工厂化生产要求，需要对组培技术的各个方面进行改进，以期将生产成本控制到最低。开展美国红枫愈伤组织诱变工作，培育具有优良性状的新品种，将美国红枫组织培养技术应用到工厂化生产中具有广阔的前景。

参考文献

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