蕨菜孢子无菌繁殖研究

吴春华 王淼 王媚 孙丽娜 石元亮

摘要[目的] 探讨蕨菜孢子无菌繁殖的最佳培养方法。[方法] 以蕨菜孢子为材料，研究消毒方式、赤霉素（GA3）浓度、光照和温度、无机盐和糖浓度对孢子萌发、原叶体发育、原叶体增殖、幼孢子体诱导的影响。[结果] 5%NaClO溶液消毒5 min为蕨菜孢子最佳消毒方式；在含有0.2 mg/L GA3的培养基上，孢子萌发速度明显提高，比CK提前13 d，心形原叶体出现时间也提前10 d；MS是蕨菜孢子萌发的最佳培养基，蕨菜孢子萌发温度最好在20～25 ℃，心形原叶体必须在光照条件下才能形成；蕨菜原叶体增殖最适培养基是MS，此时增殖系数达79.1；蕨菜原叶体增殖培养基最适糖浓度为1%，此时增殖系数是88.3；KT激素有利于蕨菜孢子体形成，最佳培养基为MS+ KT 0.2 mg/L，叶片最多（4.6个），孢子体出现时间最短（35 d）。[结论] 该研究结果可为蕨菜产业化快繁体系建立提供理论依据。

关键词蕨菜；孢子；培养方法

中图分类号S647；Q945.51文献标识码A文章编号0517-6611（2017）12-0118-04

Abstract[Objective] To explore the best cultural method of sterile propagation of Pteridium aquilinum spores. [Method] Effects of disinfection way，GA3 concentration，illumination，temperature， inorganic salt and sucrose concentration on P. aquilinum spore germination， prothallus growth， prothallus proliferation and young sporophytes induction were studied.[Result] The best disinfection way of P. aquilinum spores was 5%NaClO for 5 mins. In the medium containing 0.2 mg/L of GA3， the spores germinated significantly faster，which was 13 days earlier than control group， the heartshaped prothallus appeared 10 days in advance. MS was the best medium for germination of P.aquilinum spores. The optimal temperature range for germination was 20～25 ℃， and heartshaped prothallus formed only in adequate light. The most suitable concentration of inorganic salt and sucrose for multiplication medium of P. aquilinum prothallus were MS and 1%， in which the proliferation coefficients were 79.1 and 88.3 respectively. Hormone KT was beneficial for forming the spores of P. aquilinum and its optimal concentration for medium was MS+ KT 0.2 mg/L， in which the number of leaves was up to 4.6， and spores first appeared on the 35th day after inoculation.[Conclusion]This results provide a theoretical basis for industrial rapid propagation system of P. aquilinum.

Key wordsPteridium aquilinum；Spores；Cultural method

蕨类植物是古老的维管植物，也是植物界系统演化中一个独特的自然类群，其生活史有配子体和孢子体[1-2]。孢子繁殖是蕨类植物进行自我繁衍和发展进化的最主要途径[3]。蕨菜[Pteridium aquilinum（ L.）Kuhn]是凤尾蕨科（Pteridaceae）多年生草本植物，别名蕨、如意菜、龙头菜、蕨薹，是医食两用的林下野生蔬菜[4-5]。蕨菜以未展开的幼叶和幼嫩叶柄供食，营养丰富，清香适口，是广大群众喜食的一种山野菜[6]。该研究通过无菌繁殖技术筛选出蕨菜孢子的最佳培养条件，培育成蕨菜种苗，为蕨菜大棚栽培大量繁殖和开发利用提供充足的种苗，同时进行蕨菜深加工，实现蕨菜的经济价值，也为农民提供一条致富道路。

1材料与方法

1.1材料蕨菜孢子成熟期，采集叶片带有成熟孢子的羽片，平铺在报纸上阴干，一般在3 d叶片干燥后，用手轻轻拨动报纸上的干燥羽片，使绝大部分的孢子和孢子囊都散落在报纸上，将其装入干净硫酸纸袋内备用。

1.2方法

1.2.1消毒方式對孢子萌发和原叶体生长的影响。取成熟的孢子，在蒸馏水中浸泡12～24 h，装于1.5 mL离心管中。设置2种消毒剂：①5%NaClO溶液，消毒时间分别为3.0、5.0和7.0 min；②0.1% HgCl2溶液，消毒时间为1.5、2.5和3.5 min。将加入消毒剂的离心管充分振荡，放于2 000 r/min离心机中离心3～5 min，弃上清液，无菌水冲洗4～5遍后离心，加入7.5 mL的无菌水，移液枪取0.75 mL均匀接种在MS培养基表面，每处理各接种10瓶。培养室温度为（25±2）℃；荧光灯光源，每天光照10 h，光照强度1 500～2 000 lx。调查项目为污染率、孢子萌发时间、原叶体生长状态。

1.2.2

赤霉素（GA3）浓度对孢子萌发的影响。以MS为基础培养基，分4个水平加入GA3：0（CK）、0.1、0.2、0.4 mg/L，观察孢子萌发时间，每处理各接种10瓶，培养条件同“1.2.1”。调查项目为孢子萌发时间、心形原叶体出现时间。

1.2.3

培养基对孢子萌发和原叶体生长的影响。培养基采用Knops，MS，1/2MS、1/4MS（大量和微量元素为MS培养基全量的1/2、1/4，铁盐和有机物含量与MS培养基相同），pH 5.8，琼脂6.8 g/L。培养基经121 ℃高压灭菌20 min。孢子用5%NaClO溶液消毒5 min，待培养基冷却后将无菌孢子悬浊液均匀接种（每个瓶中接种0.75 mL），每处理各接种10瓶。轻微晃动培养瓶使孢子均匀散开，培养条件同“1.2.1”。调查项目为孢子萌发时间、心形原叶体出现时间、原叶体量。

1.2.4

光照和温度对孢子萌发的影响。以MS为基本培养基，将经过0.2 mg/L 浓度GA3处理的孢子分别进行光培养（培养条件同“1.2.1”）和暗培养（无光照），每种光照处理培养温度又设为15、20、25、30 ℃，每处理各接种10瓶。调查项目为孢子萌发时间、心形原叶体出现时间、原叶体颜色。

1.2.5

无机盐浓度对原叶体增殖的影响。为筛选出原叶体增殖最适合的无机盐浓度，采用MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS共4种培养基（所有培养基均含3%蔗糖，pH 5.8，琼脂6.0 g/L）对原叶体进行增殖培养，每处理各接种10瓶，培养条件同“1.2.1”。调查项目为原叶体颜色、原叶体长势、增殖系数（增殖系数=增殖后的原叶体鲜重/接种时的鲜重）。

1.2.6

糖浓度对原叶体增殖的影响。以MS为基础培养基，调查不同蔗糖浓度（0、1%、3%、5%、7%）对蕨菜原叶体增殖的影响，每处理各接种10瓶，培养条件同“1.2.1”。调查项目为原叶体颜色、原叶体长势、增殖系数（增殖系数=增殖后的原叶体鲜重/接种时的鲜重）。

1.2.7

幼孢子体的诱导。将原叶体接种于含0、0.1、0.2、0.5 mg/L激动素（KT）的MS培养基上，培养基表面保持有水滴（利于受精），每处理各接种10瓶。调查项目为幼孢子体出现时间、幼孢子体数、叶片数、幼孢子体长势。

2结果与分析

2.1消毒方式对孢子萌发和原叶体生长的影响

由表1可知，采用5%NaClO溶液消毒5.0 min的孢子消毒效果较好，40 d左右就能萌发，培养基上均见到少量孢子发育出绿色小点（图1），进一步培养60 d见到对称心形原叶体（图2），90 d后原叶体逐渐成熟，成熟的原叶体边缘及背腹面着生较多的毛状体（图3）。采用HgCl2溶液消毒能明显降低污染率，但HgCl2穿透性强，影响蕨菜孢子的萌发，且随着消毒时间延长，配子体发育缓慢，甚至不能形成片状体。故5%NaClO溶液消毒5 min为孢子最佳消毒方式。

2.2GA3浓度对孢子萌发的影响

从表2可以看出，GA3对蕨菜孢子萌发有促进作用，其中以0.2 mg/L GA3效果明显，在含有0.2 mg/L GA3的培养基上，孢子萌发速度明显提高，比CK提前13 d，心形原叶体出现时间也提前10 d。

2.3培养基对孢子萌发和原叶体生长的影响

由表3可知，4种培养基上的孢子在接种后均可萌发，MS和Knops培养基中的孢子经33～34 d萌发，比其他培养基早3～5 d，且萌发后原叶体生长发育较快。MS培养基上原叶体鲜重最大，在配子体发育阶段，低无机盐浓度培养基中配子体呈黄绿色且萌发量也少，生长发育缓慢，不利于孢子体苗的形成。综合孢子萌发量和原叶体生长情况来看，MS是蕨菜孢子萌发的最佳培养基。

2.4光照和温度对孢子萌发的影响

从表4可以看出，光照对蕨菜孢子的萌发影响不大，但对心形原叶体的形成影响甚大，在没有光照条件下心形原叶体是不能形成的。在15～30 ℃范围内，随温度的升高，孢子萌发时间和心形原叶体出现时间也缩短，但低温（15 ℃）和高温（30 ℃）时原叶体颜色是黄绿，只有20 ℃和25 ℃范围生长的原叶体颜色是翠绿。因此，蕨菜孢子萌发温度最好在20～25 ℃，心形原叶体必须在光照条件下才能形成。

2.5无机盐浓度对原叶体增殖的影响

由表5可知，培养基中大量元素浓度对蕨菜配子体的增殖有很大的影响。1/2MS培养基中原叶体的增殖总量比MS的少，1/4MS培养基上原叶体有明显的营养不良倾向，原叶体增殖后呈黄绿色，长势差，而在1/8MS培养基上，原叶体生长一段时间后即死亡。蕨菜原叶体增殖最好的培养基是MS（图4），此时增殖系数达79.1。

2.6糖浓度对原叶体增殖的影响

由表6可知，培养基中糖浓度对蕨菜原叶体增殖有很大影响。其中，MS+1%蔗糖培养基上的原叶体增殖系数最大（88.3），蔗糖浓度超过或低于1%，均不利于原叶体的增殖及生长。蕨菜原叶体增殖最佳培养基为MS+1%蔗糖，此时增殖系数是88.3。

2.7幼孢子体的诱导

从表7可以看出，在MS培养基中幼孢子体没有形成，表明KT对幼孢子体的形成非常重要。在含有KT的MS培养基中均出现幼孢子体，其中MS+KT 0.2 mg/L培养基上的幼孢子体叶片最多（4.6个），长势最好（图5），幼孢子体出现时间最短（35 d），说明适宜浓度的KT有利于幼孢子体的形成。

2.8幼孢子体生根诱导及移栽

组培方式诱导出的幼孢子体需要进行生根诱导，取无根孢子体，接种在含0.5 mg/L NAA的MS培养基上，约20 d，形成完整的蕨菜植株。待孢子体长至4 cm左右，根系2～3 cm长时，进行炼苗移栽。移栽基质为50%草炭+50%细河沙，洒水保持湿润。

3结论

（1）5%NaClO溶液消毒5 min为蕨菜孢子最佳消毒方式；在含有0.2 mg/L GA3的培养基上，孢子萌发速度明显提高，比CK提前13 d，心形原叶体出现时间也提前10 d；MS是蕨菜孢子萌发的最佳培养基。

（2）蕨菜孢子萌发温度最好在20～25 ℃，心形原叶体必须在光照条件下才能形成。

（3）蕨菜原叶体增殖最好的培养基是MS，此时增殖系数达79.1；蕨菜原叶体增殖最佳培养基为MS+1%蔗糖，此时增殖系数是88.3。

（4）KT有利于蕨菜幼孢子体形成，最佳培养基添加浓度为MS+ KT 0.2 mg/L，此时蕨菜叶片最多（达4.6个），长势最好，幼孢子體出现时间最短（35 d）。

参考文献

[1] 王振业.育苗基质和播种方法对蕨菜孢子繁殖的影响[J].草原与草坪，2010，30（5）：56-58.

[2] 张有生.蕨菜的人工繁殖方法[J].河北林业科技，2002（4）：34-35.

[3] 孙起梦，刘兴剑.几种蕨类植物的孢子繁殖试验研究[J].安徽农业科学，2010，38（25）：13571-13572，13576.

[4] 吴春华，石元亮，王淼.蕨菜根状茎的组织培养技术研究[J].园艺与种苗，2013（11）：41-44.

[5] 藤瑶，王晓花，王德斌，等.蕨菜的栽培技术[J].延边大学农学学报，2002，24（4）：279-284.

[6] 王淼，孙丽娜，吴春华，等.东北蕨菜的GGB组培移栽技术及驯化[J].园艺与种苗，2016（1）：27-29.