应用响应面优化辣木γ—氨基丁酸富集工艺研究

段双梅 赵恒 马燕 苏小琴 万晶琼 李振华 张石先 张磊 赵明

摘 要 通过富集方式和干燥方法的单因素实验，最陡爬坡试验和响应面设计，优化辣木鲜叶γ-氨基丁酸（γ- aminobutyric acid，GABA）的富集工艺。建立的辣木鲜叶中GABA最适富集条件为辣木鲜叶在45 ℃下，真空处理34 h，然后50 ℃干燥。该条件处理的辣木GABA含量为（19.70±0.16）mg/g，是对照的2.63倍。

关键词 辣木；真空处理；γ-氨基丁酸；响应面设计

中图分类号 TS201 文献标识码 A

Abstract The γ-aminobutyric acid（GABA）enrichment technology in Moringa was optimized through single factor experiments， the steepest ascent experiment and a response surface design. An optimized technology was developed as follow： The fresh leaves of Moringa were treated in vacuum at 45 ℃ for 34 h and dired at 50 ℃. The content of GABA in Moringa was（19.70±0.16）mg/g， it was 2.63 times than that of the control. This study would provide technical support for the development of GABA-rich Moringa food.

Key words Moringa oleifera； vacuum treatment； γ-aminobutyric acid； response surface designs

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.027

辣木（Moringa oleifera）為辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa），多年生速生树木，最早产于印度[1]。其根、茎、叶、花、种子、树枝及树皮等均含有丰富的营养及药用成分，如高蛋白质、高钙、维生素、氨基酸等[2-3]。研究发现辣木具有活化细胞、增强免疫力、保护心脏、降低血脂、预防癌症等保健功效[4]。2012年，中国卫生部批准辣木鲜叶为新资源性食品（2012年第19号）。近年来，随着人们对健康的日渐重视和大健康产业的兴起，辣木的营养价值、功能成分的研究及健康产品的开发受到广泛关注[5]。随着种植面积不断扩大以及进入丰产期，辣木产量将极大地增加，精深加工将是产业可持续发展的关键。

GABA是哺乳动物神经系统中枢中最重要的抑制性神经递质[6]，还具有降血压[7-8]、降低胆固醇[9-11]、改善脑机能、抗惊厥、预防和调治癫痫[12]、活化肾肝功能、促进精子受精等多种生理活性及保健功能[13-14]。随着人年龄增长及精神压力增大会导致 GABA的积累异常困难，需通过日常饮食补充才能有效地改善这种状况[15]。2009年，中华人民共和国卫生部批准GABA为可用于食品生产加工的新资源食品[16]。目前，GABA功能性食品、保健品的研究开发已成为食品领域的研究热点之一。

关于GABA食品的研究与开发火热，主要有3种方式加工GABA食品，第一是通过真空等物理方式处理食品原料。如：日本、中国、斯里兰卡等国[17]有报道，通过厌氧或红外线处理鲜叶，加工GABA绿茶[18]、红茶[19]、普洱茶[20]、白茶[21]、桑叶[22]等产品。又如，通过处理原料加工富含GABA萌芽糙米[23]、玉米[24]、米胚芽[25-26]、 GABA米糠[27]等产品。第二是应用产GABA的微生物发酵加工富含GABA的食品。如应用产GABA微生物发酵加工富含GABA的豆豉[28]、酱和腐乳[29]和四川泡菜[30]等发酵食品。此外，乳酸菌参与酸奶、奶酪的发酵，同时部分乳酸菌也能产生GABA，因此将二者结合可以加工出富含GABA的发酵乳制品。如Wang[31]、Nomur[32]发现应用乳酸菌发酵加工富含GABA奶酪。第三是外源添加加工富含GABA的食品。已有加工富含GABA的番茄红素[33]、桑叶豆腐脑[34]和水晶粉丝[35]等专利。

尽管有很多研究和专利开展富含GABA的食品研究[35-38]，但未见富含GABA的辣木研究报道。基于深加工产品是解决辣木产能过剩的重要途径，以及GABA产品具有的广阔市场前景，将两种新资源性食品原料结合，研究加工富含GABA的辣木产品，具有重要理论与实际意义。为此，笔者研究辣木GABA富积条件，为富含GABA的辣木产品加工提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 辣木样品 本研究所用材料，分别购置于云南曲靖与广西南宁。其中富积方式、干燥方式以及爬坡实验的材料购于云南曲靖；响应面及验证试验所用的辣木鲜叶购自广西南宁。

1.1.2 主要试剂 色谱纯甲醇、乙腈为美国TEDIA试剂公司产品；乙酸、四氢呋喃、三乙胺、氯仿、无水乙酸钠、邻苯二甲醛（OPA）、硼酸为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器 应用安捷伦1200系列HPLC系统，包括LC-20AB溶剂输送单位，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱（40 ℃），G1321A的荧光检测器（激发波长340 nm，发射波长450 nm），LC Ver1.23工作站。色谱柱为Agilent Hypersil AA-ODS（2.1×200 mm，5 μm，U.S.A），配有保护柱为Hypersil ODS柱（20×2.1）（安捷伦，美国）。

1.2 方法

1.2.1 辣木GABA提取 辣木干燥叶粉碎过60目筛，称取1.0 g样品，用量筒量取70 ℃水100 mL，加入三角瓶中，沸水浴提取1 h，过滤，定容至100 mL。取1 mL滤液，加入200 μL氯仿，静置5 min，离心5 min（4 ℃ 12 000 r/min），取上清液。上清液用0.45 μm硝酸纤维素膜过滤，滤液为待测液。

1.2.2 辣木GABA富集工艺优化

（1）富集方式单因素试验。根据文献报道和实验室条件，各称取辣木鲜叶100 g，分别置于冻干机（FD5-series，美国金西盟国际集团）中9 h、真空干燥箱（DZF-6020，上海博讯实业有限公司）中真空（0.07 MPa）处理9 h以及自制容器中充氮处理9 h。每种处理重复2次，处理之后，按下述优化的干燥方式干燥，按方法提取测定样品GABA含量，研究富集方式对辣木GABA含量的影响。

（2）干燥方式单因素试验。各称取辣木鲜叶100 g，分别用鼓风50 ℃烘干、鼓风60 ℃烘干、鼓风80 ℃烘干、自然阴干（20 ℃）和微波干燥[G70F23N1P-M8（S0），广东格兰仕微波炉电器制造有限公司]，每种干燥方式重复2次，干燥之后按方法提取并测定GABA含量，研究干燥方式对辣木GABA含量的影响。

（3）爬坡试验。在确定处理方式的基础上，参考GABA茶叶[39]等加工工艺，各以100 g鲜叶，开展真空处理温度/时间为25 ℃/6 h、30 ℃/12 h、35 ℃/18 h、40 ℃/24 h、45 ℃/30 h、50 ℃/36 h的爬坡实验。每个处理重复2次。干燥后测定GABA含量，初步研究温度与时间对辣木GABA含量的影响。

（4）响应面设计。基于爬坡试验的基础，根据中心复合原理，利用JMP 10.0软件以GABA的生成量（Y）为响应值，温度（X1，40～50 ℃）和时间（X2，24～36 h）为因子水平，中心点数为2个，重复次数为1次，进行响应曲面中心复合设计。每个实验处理重复2次，按方法干燥、提取测定样品的GABA含量。以真空处理温度、时间为考察因素，以辣木中GABA含量为指标进行曲面三维图的绘制，预测最佳处理温度、时间及GABA含量。并根据预测条件重复2次实验，测定含量，验证响面优化加工工艺。

1.2.3 辣木GABA含量测定

（1）色谱条件。采用自动进样器进行OPA柱前在线衍生，衍生程序为抽取硼酸缓冲液5.0 μL，抽取衍生试剂（OPA）0.2 μL，洗针，抽取1.0 μL标液或样品，混合9次后进样。流动相A为25 μmoL无水乙酸钠、0.018%三乙胺、0.3%四氢呋喃，pH7.2；流动相B为40%乙腈、40%甲醇和0.1%冰醋酸。洗脱梯度程序：0～1 min，B液从5%线性梯度增加至15%；1～11 min，B液从15%线性梯度增加至18%；11～25 min，B液从18%线性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%线性梯度增加至100%B；27～31.5 min，B液保持在100%；31.5～31.9 min，B液由100%降低至5%；32 min程序停止；以5% B液后运行平衡6 min；流速为0.5 mL/min。柱温为40 ℃。

1.3 数据处理

每一样品提取2次，每个提取液测定2次，以mean±SD表示平均值。实验数据进行单因素方差分析，组间采用最小显著差数法进行两两比较，p<0.05为差异显著。所有的统计分析和數据处理应用软件IBM spss statistics 22（SPSS Inc.， Chicago， IL）进行。

2 结果与分析

2.1 GABA辣木茶加工工艺优化

2.1.1 富集方式的优化 应用HPLC测定3种方式处理的辣木样品的GABA含量，均值与方差分析结果见图1。由图1可知，真空处理加工的辣木GABA含量显著高于其他处理（p<0.05）。因此，本研究后续试验对辣木的富集方式均采用真空处理。

2.1.2 干燥方式的优化 按方法进行干燥方式单因素实验，应用HPLC测定5种干燥方式的辣木样品GABA的含量，部分测定色谱图见图2。GABA保留时间为22.373 min，且与其他氨基酸基线分离。各干燥方式样品的平均值与比较结果见图3。由图3可知，自然干燥和50 ℃干燥的辣木GABA含量无显著差异（p>0.05），但是二者的含量显著高于其他处理方式（p<0.05）。自然干燥耗时长、易受天气制约、不易控制，故本研究的后续实验中选择50 ℃鼓风烘干。

2.1.3 最陡爬坡试验结果 各辣木样品中GABA含量，均值与方差分析结果见图4。由图4可知，在温度40～45 ℃和时间24～30 h范围，GABA含量随温度升高和时间增加而升高。在温度/时间为45 ℃/30 h时达到拐点；在温度/时间为45～50 ℃和30～36 h范围内，GABA含量随着温度升高和时间增加而缓慢降低。因此，通过最陡爬坡试验确定了后续实验中，真空处理的温度为40～50 ℃，时间为24～36 h。

2.1.4 响应曲面试验结果 按方法进行响应面实验设计处理，测定各处理辣木样品GABA含量，结果见表1。对表1中GABA实测值的数据用最小二乘法拟合的二次多项方程，进行多元回归拟合，获得Y对处理温度（X1）和处理时间（X2）的二次多项回归方程：

Y=19.51-0.073×[（X1-45）/5]+1.45×[（X2-30）/6]-0.63×[（X1-45）/5]×[（X2-30）/6]-4.64×[（X1-45）/5]2-0.84×[（X2-30）/6]2，式中Y为预测响应值。

应用F检验检测响应曲面设计的多元回归方程及失拟显著性检验两者的有效性。从响应面回归方程的方差与均值分析，F>0.01（5，14）、p<0.01，F极显著。F检验结果表明该响应面模拟效果显著，其矫正决定系数R2=0.97，表示此模型可以解释97%的GABA总变异。

2.1.5 響应面两因素交互作用分析 通过JMP 10.0软件分析温度和时间对辣木样品中GABA含量的影响，并绘制交互作用图（图5）和响应曲面图（图6）。由图5、6可知，真空处理的时间和温度2个因素间的交互作用极显著。随着温度的升高，辣木样品GABA含量逐渐增加，且在真空处理时间33.43 h、温度44.69 ℃时达到最大值为20.23 mg/g，随后缓慢减少。即真空处理的时间34.43 h、温度44.69 ℃，在此条件下辣木茶中GABA富集量为20.23 mg/g。

2.2 模型的优化和验证

应用响应面设计分析得到辣木中GABA的富积最优条件为：温度44.69 ℃、时间34.43 h，辣木中GABA含量可达20.23 mg/g。为了检验模型的准确性，分别称取辣木鲜叶1 000 g，选择处理温度45 ℃、处理时间34 h，重复2次，真空处理试验。测定发现GABA的平均为（19.70±0.16）mg/g。综上优化发现辣木中GABA富集的工艺如下：鲜叶45 ℃真空处理34 h，50 ℃鼓风干燥。

3 讨论

研究发现辣木对糖尿病、高血压、心血管病、肥胖症、免疫力低下、坏血病、肿瘤等疾病都有显著的治疗作用[40]。由于辣木的保健功能显著，以及批准成为新资源食品，国内辣木食品的开发如火如荼，如：辣木片剂、辣木绿茶、辣木含片、辣木面包、辣木营养豆腐、辣木营养饮料、辣木保健灵芝等产品，成为补充人体营养、增强免疫力、预防疾病、提高生活品质、保证身体健康的产品。随着健康中国成为国家战略，具有多种保健功能的辣木和辣木产品将成为大健康产品的重要组成部分，具有广阔的市场前景。

GABA是一种具有多种生理功能的新资源食品，其在药品、食品、保健品等领域都具有重要的应用[41]。本研究创新地将2种新资源食品结合起来，研究加工富含GABA的辣木产品，加工的产品同时具有辣木和GABA的保健功能，因此可能具有广阔的市场前景。但是加工的富含GABA辣木产品的保健功能需要进一步研究。

GABA广泛分布于植物中，具有抵抗逆境的功能。一般来讲，植物组织中的GABA含量较低，约0.03～2.00 μmoL/g FW，但在不同外界应激条件包括热击、机械震动、缺氧、植物激素等刺激后可成倍增加。例如，缺氧条件可使水稻幼苗的GABA含量提高到8 μmol/g FW；大豆叶片的GABA含量在机械刺激、冷击5 min后，可增加20～40倍，上升到1～2 μmol/g FW[42]。利用植物对外界的应激性原理，可以对植物GABA进行富集，如通过厌氧处理、浸泡处理、红外线照射、低温冲击、叶面喷施等技术处理茶叶鲜叶，加工GABA茶叶[43]。其中厌氧、低温、真空等以物理方法提高GABA含量，具有工艺简单、易于后续处理、天然等优点，广泛应用于茶叶、桑叶等植物材料的GABA加工[44-45]。植物富集法主要通过改变温度、压力、时间、研磨和氧浓度等因素增加GABA含量。根据相关报道，邹锋扬等[46]真空处理铁观音品种茶树鲜叶，GABA含量为2.11 mg/g；王芳等[21]真空处理白茶品种茶树鲜叶，GABA含量为2.41 mg/g；边伟等[47]采用O2 ∶ CO2 ∶ N2=1 ∶ 1 ∶ 8处理桑叶8 h，GABA含量为2.28 mg/g；何娜等[48]低温处理结球甘蓝内叶，GABA含量为2.41 mg/g；林智等[49]真空处理茶鲜叶，GABA含量为3.33 mg/g；陈庆等[50]真空/氧气交替处理桑叶，GABA含量为4.48 mg/g；朱云辉等[51]用苦荞子在黑暗培养箱中发芽，测定苦荞子叶GABA的含量为0.23 mg/g。与已有研究相比，本研究首次采用响应面设计的方法对GABA富积工艺中的温度与时间这两个关键因素进行了优化，不仅优化的工艺与已有报道不同，且GABA含量达到了19.70 mg/g。

植物体中GABA主要由GABA支路合成和转化：由谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxy-lase， GAD， EC 4.1.1.15）催化谷氨酸脱羧合成GABA，GABA又在GABA转氨酶（GABA transaminase， GABA-T， EC2.6.1.19）的作用下和α-酮戊二酸发生转氨作用形成琥珀酸半醛进入三羧酸循环[52]。其中GABA 转氨酶在厌氧情况下活性降低，而谷氨酸脱羧酶则在厌氧、有氧的条件下，均有活性。本研究选择真空处理辣木鲜叶，就是利用厌氧条件下，谷氨酸脱羧酶将谷氨酸脱羧合成GABA，而GABA转氨酶活性降低，促使GABA累积的原理。本研究优化的温度，是辣木谷氨酸脱羧酶的最适反应温度，优化的时间是谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸形成GABA的反应持续时间，与谷氨酸脱羧酶活性持续时间以及辣木的谷氨酸含量有关。

本研究应用响应面技术优化了辣木GABA富积工艺，研究中发现原料对产品GABA含量影响显著。本研究所用材料，分别购置于云南曲靖与广西南宁，研究中发现购于云南曲靖的辣木鲜叶，处理后GABA含量低于广西南宁样品。推测辣木品种、生长地区以及时间导致辣木鲜叶GABA以及谷氨酸含量差异，而这种差异决定了富积之后的辣木产品中GABA含量。因此，开展辣木GABA产品加工，首先需要检测辣木原料的GABA含量，本课题组正在检测不同产地的辣木GABA含量。

总之，通过干燥方式、富集方式的单因素实验，最陡爬坡实验、响应面设计与验证，本研究建立了以辣木鲜叶为原料，45 ℃真空处理34 h，50 ℃热风干燥的工艺，该工艺处理的辣木GABA含量达19.70 mg/g左右，为今后开发高含量的GABA辣木食品提供了理论依据。

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