楸树体胚发生过程中5种酶的活性变化研究

金玉佩 刘佳 纪若璇 梁宏伟 张丽萍

摘 要 以楸树体胚发生过程中不同时期的组织为材料，分析测定体胚发生过程不同阶段的过氧化物酶（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、腺嘌呤核苷三磷酸酶（ATP）、淀粉酶（AMY）、酯酶（EST）这5种酶类的活性，以探讨楸树胚胎发生过程中的生理生化变化特征。结果表明：楸树体胚发生过程中的不同时期，这5种酶类的活性也会相应发生变化。POD、SOD和EST酶活反应在旺盛增殖分化的黄色胚性愈伤组织（YEC）的活性最高，ATP和AMY酶活反应在开始萌发的绿色子叶胚（GCE）中活性最高。在黑色愈伤组织和非胚性愈伤组织中，SOD、AMY和EST酶的活性很低，与此类组织的不能分化及处于生长停滞状态具有一定相关性。

关键词 楸树； 体细胞胚胎发生； 酶活测定

中图分类号 Q418 文献标识码 A

Abstract In this study， in order to explore the physiological and biochemical changes in the embryogenesis of C. bungei， we analyzed the activities of five enzymes， such as amylase（AMY）， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD）， enzyme adenosine triphosphate（ATP）and esterase（EST）， in different stages of somatic embryogenesis. The results showed that the five kinds of enzyme activities could change in accordingly to different stages on the process of somatic embryogenesis in C. bungei. The POD， SOD and EST enzyme activities were the highest in yellow embryogenic callus which had strong proliferation and differentiation， ATP and AMY enzyme activities were the highest in the green cotyledonary somatic embryo which was germinating. In black callus and non-embryogenic callus， the enzyme activities of SOD， AMY and EST were very low， which were related to the indifferentiation and growth stagnation of these tissues.

Key words Catalpa bungei； somatic embryogenesis； enzyme activity assay

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.011

楸樹（Catalpa bungei C. A. Mey.）属紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa）落叶大乔木，是中国特有的珍贵用材和观赏树种。楸树自然状态下自交不亲和[1]，自然结实率低。目前楸树通常采用嫁接和扦插等方式进行无性繁殖，嫁接法繁殖揪树须培育砧木、嫁接品种接穗，技术环节多，育苗周期长[2]。楸树扦插有多种因素影响扦插成活率，其中嫩枝扦插有较高的成活率[3]，且有关扦插的生根机理还有待进一步研究[4]。在几位学者的研究下已经建立楸树组织再生体系。体细胞胚胎发生具有快速、高增殖率及高再生率等优点，能使楸树新品种快速繁殖。

目前，许多裸子植物和被子植物都通过体细胞胚途径获得了再生植株，国内外有关体细胞胚发生的研究日益增多。在国内，关于植物体细胞胚胎发生机制的研究进展比较缓慢，尤其是关于胚胎相关基因的表达与调控、人工种子制备以及体细胞胚胎的生产应用方面的研究较国际上先进水平落后很多[5]。国内研究较多梓属植物有花楸、滇楸、楸树等，目前都已建立了组培再生体系。其中研究了滇楸体胚发生过程中细胞生物学和特异蛋白[6]，花楸种子生物学和体细胞胚再生体系的建立[5]。甚少关于体胚发生过程中关键酶活性的研究，而有关楸树在体胚发生过程中各酶类的活性变化还未见报道。

本试验通过对楸树体细胞胚胎发生过程中不同发育阶段组织材料的代谢相关酶类（过氧化物酶、超氧化物歧化酶、腺嘌呤核苷三磷酸酶、淀粉酶和酯酶）的活性测定和分析，有助于在生理生化水平上研究楸树体细胞胚发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

以6月底至7月初楸树未成熟合子胚进行愈伤组织诱导，获得的初代愈伤组织是非胚性愈伤组织，为膨大松散的淡黄绿色无定型组织团，继代培养增殖后转变为无明显变化；以初代愈伤组织诱导胚性愈伤组织，在体胚分化诱导过程中最先出现的是黑色愈伤组织，继而在黑色愈伤组织上分化产生淡黄色胚性愈伤组织，为紧实细腻的淡黄色颗粒状组织团。继续培养黄色胚性愈伤组织，会出现分化产生白色子叶胚，继续分化产生绿色子叶胚（图1）。

多次继代培养后挑取非胚性愈伤组织（Non-embryogenic callus， NC）、黑色愈伤组织（Black callus， BC）、黄色胚性愈伤组织（Yellow embryogenic callus， YEC）、白色子叶胚（White cotyledon embryo， WCE）和绿色子叶胚（Green cotyledon embryo， GCE）各1 g，锡纸包裹过液氮中速冻后置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液提取 分别取-80 ℃保存的非胚性愈伤组织材料和不同发育时期的胚性愈伤组织材料各1.0 g，加入聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVPP）0.2 g，边加液氮边进行研磨，研磨成粉后加入磷酸盐缓冲液（PBS）5.0 mL（pH7.8，使用前预冷），继续研磨成匀浆后，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液重复上述步骤，取上清液即为酶提取液，分装于200 μL离心管中，用于酶活性测定分析。

1.2.2 酶活测定 过氧化物酶活性的测定：采用创愈木酚法[7]测定POD酶活性；超氧化物岐化酶活性测定：以SOD对NBT光化还原的抑制作用来定量测定SOD酶活性[8]；腺嘌呤核苷三磷酸酶活性测定：通过酶促反应所释放的无机磷的量[9]来测定ATP酶活性；淀粉酶活性测定：参照李雯等[10]改进的用淀粉酶分解麦芽糖的方法来测定AMY酶活性；酯酶活性测定：分解醋酸-α-萘酯的方法[11]来测定EST酶活性；使用美国Thermo紫外可见光分光光度计Evolution 220测定不同发育阶段的各酶类的活性，重复3次。

1.3 数据处理

将得到的数据结果用Microsoft excel 2010软件进行处理，生成图表并分析。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段的过氧化物酶活性变化

由图2可以看出，各组织中过氧化物酶活性由高到低依次为：黄色胚性愈伤组织、黑色愈伤组织、绿色子叶胚、非胚性愈伤组织和白色子叶胚。黄色胚性愈伤组织在几种组织中的过氧化物酶活性最高，达到15.64 U/（g·min），表明在黄色胚性愈伤组织中存在旺盛的POD酶生理生化代谢过程，以利于体细胞胚胎的分化发生。白色子叶胚时期为体细胞胚发育成熟阶段，其过氧化酶活性最低，仅为6.78 U/（g·min），说明在萌发之前处于较低的POD生理生化代谢状态下，与成熟种子胚的状态相类似。

2.2 不同发育阶段的超氧化物歧化酶活性变化

由圖3可以直观地观察到各发育时期的组织中超氧化物歧化酶活性由高到低依次为：黄色胚性愈伤组织、绿色子叶胚、白色子叶胚、非胚性愈伤组织和黑色愈伤组织。SOD是植物细胞中清除活性氧第一个发挥作用的酶。黄色胚性愈伤组织中存在活跃的生长分化过程，分化产生体细胞胚胎，故其细胞内生理生化代谢反应旺盛，高活性的SOD酶有助于清除快速细胞生长分裂过程中产生的活性氧自由基，故其组织内SOD酶活性最高，达到11.11 U/g；黑色愈伤组织是黄色胚性愈伤组织的上一发育阶段，其生长缓慢近乎停滞，因而SOD酶活性最低，仅为1.98 U/g。白色子叶胚与绿色子叶胚时期中SOD酶活性较为稳定，无明显变化。

2.3 不同发育阶段的腺嘌呤核苷三磷酸酶活性变化

由图4可以观察到各发育时期组织中腺嘌呤核苷三磷酸酶活性由高到低依次为：绿色子叶胚、白色子叶胚、黑色愈伤组织、黄色胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。ATP酶活性越高，能够为细胞生长分化发生提供的能量越多。非胚性愈伤组织主要由含有大液泡的薄壁细胞构成，几乎不具有分化再生能力，仅仅维持增殖，其组织细胞内ATP酶生理生化反应是最低的。黑色胚性愈伤组织是黄色胚性愈伤组织的前体阶段，向胚性愈伤组织转变过程中需要耗能巨大，其酶活达到197.83 μmol/（g·min），为非胚性愈伤组织的2.14倍；而绿色子叶胚是白色子叶体胚开始萌发成苗的阶段，绿色子叶胚进一步发育即可形成完整小植株，其细胞内生理生化代谢最活跃，酶活性为218.67 μmol/（g·min），因此组织内ATP酶的生理生化活性最高。

2.4 不同发育阶段的淀粉酶活性变化

由图5可以明显看到淀粉酶活性由高到低依次为：绿色子叶胚、非胚性愈伤组织、黑色愈伤组织、白色子叶胚和黄色胚性愈伤组织。淀粉酶用于水解淀粉麦芽糖，并进一步水解为葡萄糖后进入糖酵解供给能量，在萌发的种子中活力最强。绿色子叶胚是正在萌发的体胚，其组织细胞内生理生化代谢旺盛，酶活达到16.48 mg/（g·min），不断地降解淀粉为其生长发育提供大量能量，故其淀粉酶活性最高。在其他体胚发育阶段的淀粉酶活性变化差异不大。

2.5 不同发育阶段的酯酶活性变化

由图6可以明显观察到酯酶活性在不同组织中差异较大。酯酶活性由高到低依次为：黄色胚性愈伤组织、白色子叶胚、绿色子叶胚、黑色愈伤组织和非胚性愈伤组织。酯酶能够催化水解脂肪酸族和芳香族酯类化合物，参与组织细胞内相对较为活跃的各类生理反应。黄色胚性愈伤组织在培养过程中不断分化产生体细胞胚胎，其细胞内各类代谢反应活跃，其EST酶活性达到74.53 U/（g·s），因此其组织细胞内酯酶活性最高。非胚性愈伤组织与黑色愈伤组织酯酶活性较接近且较低，说明其组织细胞内各类生理反应相对不活跃，这与其不能分化及处于生长停滞状态相对应。

3 讨论

楸树胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织及其他发育阶段在形态上存在明显的差异，其中的各类酶活性水平也存在明显的差异。本试验发现POD、SOD和EST在黄色愈伤组织中活性最高。SOD与POD酶相互协调配合，清除植物代谢旺盛和逆境胁迫下产生的过剩自由基[12-13]。2种酶作用相互协调正如本实验中这2种酶活性变化趋势相似，黄色愈伤组织期间两酶活性最高与其活跃的生长分化旺盛状态相符合。白色到绿色子叶胚阶段POD酶活性上升与其他学者研究的滇楸[14]和花楸[15]体胚发生中POD酶活性在子叶胚时期后上升的趋势一致。EST能够催化蛋白质的去磷酸化，催化细胞信号物质的合成和转化[16]，能够水解非生理存在的酯类化合物，因此对植物可能有去毒的功能[17]。本试验EST酶活性在黄色愈伤组织中最高，与铁皮石斛球形胚和心形胚时期的酯酶同工酶[18]出现特异条带相印证。故而黄色愈伤组织内各类生理反应与其他阶段比相对较活跃，且进一步说明有相对较强的代谢过程和抗逆性。

ATP酶和淀粉酶在綠色子叶胚中活性最强。随着胚性细胞后期细胞壁的加厚，ATP酶活性沉积物出现，为胚性细胞的分裂和发育提供能量[19]。因此绿色子叶胚作为体胚萌发的初始阶段，其ATP酶活性是最强的。在杂交鹅掌楸的研究中发现胚性细胞早期和后期ATP酶活性高[20]，这与本试验中黑色愈伤组织分化到绿色子叶胚发育的ATP酶活性高相符合。沉积于胚乳组织淀粉粒边缘的淀粉酶与其细胞生理学功能紧密联系，能催化淀粉水解为种子萌发提供能量[21]。因此，绿色子叶胚淀粉酶活性最高，其生理学功能与种子相同。本试验的绿色子叶胚发育与任莺[22]文章中Ⅰ型绿色愈伤组织一致，其淀粉酶活性高与细胞学观察到淀粉粒丰富一致。

酶活性的分布和定位变化，从一个侧面反映了胚性细胞在分化和发育过程中的生理和代谢状态[15]。如上述，EST、POD和SOD 3种酶的活性强弱可作为鉴定楸树体细胞胚胎发生过程中特定时期的生化参考标记。

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