大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶的表达·纯化及鉴定

赵龙 周贤轩

摘要 [目的]获得大肠杆菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7软件对不同生物丙酮酸激酶的编码基因进行聚类分析；通过聚合酶链式反应（PCR）扩增了大肠杆菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶基因pykA，将其克隆到pET28a载体中，构建了重组质粒载体pET28a-pykA并在大肠杆菌BL21中实现了 Ⅱ 型丙酮酸激酶（PykA）的高效表达；利用镍柱亲和层析系统纯化了PykA蛋白，并进行了高效液相色谱（HPLC）检测。[结果]聚类分析结果表明，大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶与其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC检测发现Ⅱ型丙酮酸激酶PykA在体外可以高效地将ADP转化为ATP。[结论]该研究获得了 Ⅱ 型丙酮酸激酶，为ATP的合成以及 Ⅱ 型丙酮酸激酶为基础的ATP再生系统的研究提供了参考。

关键词 Ⅱ 型丙酮酸激酶；蛋白表达；高效液相色谱；大肠杆菌；ATP再生系统

中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0142-03

Abstract [Objective] The aim was to obtain the type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli.[Method] The phylogenetic analysis using MEGA7 software showed high similarity between the a mino acid sequence of type Ⅱ pyruvate kinase in Escherichia coli and that of other bacteria.Then，the pykA gene encoding type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli was amplified by using Polymerase Chain Reaction （PCR），cloned into the pET28a vector，and overexpressed in the host strain E.coli BL21.The resultant product was purified by nickel affinity chromatography，and detected by high performance liquid chromatography （HPLC）.[Result] HPLC analysis revealed that PykA efficiently converted ADP to ATP in vitro.[Conclusion] The progress in expression，purification and activity deter mination of type Ⅱ pyruvate kinase will contribute to ATP production and biosynthesis based on the ATP regeneration system.

Key words Pyruvate kinase Ⅱ；Protein expression；High performance liquid chromatography；Escherichia coli；ATP regeneration system

丙酮酸激酶廣泛分布于微生物、动物和植物体内，是糖酵解途径重要的变构调节酶，参与了糖酵解途径的底物水平磷酸化反应[1]。丙酮酸激酶的国际酶学编号为EC2.7.1.40，又称为磷酸丙酮酸激酶、丙酮酸磷转移酶，该酶在同一个有机体中存在多种同工酶[2]。在细菌中通常有2种丙酮酸激酶，即 Ⅰ 型PykF丙酮酸激酶和 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。丙酮酸激酶能够催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团转移到二磷酸腺苷（ADP）上从而生成三磷酸腺苷（ATP）和丙酮酸（PYR）[3]。ATP的合成与再生在工业生产与科学研究工作中有重要价值。丙酮酸激酶催化的ADP磷酸化生成ATP，可实现ATP的酶学方法合成以及生物合成系统中的ATP再生[4]。同时，以PEP为磷酸基团供体，丙酮酸激酶催化的核糖核苷三磷酸再生系统同样适用于其他5′-三磷酸核苷酸、6-磷酸葡萄糖及各种碱和糖修饰的核苷类似物的合成[5]。在6-磷酸葡萄糖的合成过程中，丙酮酸激酶生成的ATP作为底物被己糖激酶利用，将磷酸基团转移到葡萄糖上，生成6-磷酸葡萄糖和ADP。该反应中的副产物ADP又可以反复被丙酮酸激酶利用，作为底物重新催化再生合成ATP，从而形成了ADP与ATP相互转化的循环，不仅节约成本，还使反应更加高效[5]。

据报道，不同的NDP作为反应底物，在丙酮酸激酶催化的反应中动力学常数往往不同[6]。大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA对不同的NDP的催化效率由大到小依次为ADP、GDP、CDP、UDP，其中ADP是该酶的最适底物[7]。大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA与大肠杆菌 I 型丙酮酸激酶PykF相比，前者对ADP的催化效率比后者高出3倍。因此，相对于PykF来说，在催化ADP磷酸化的ATP酶法合成与ATP再生系统中，Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA是更好的选择。笔者克隆、表达并纯化了大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA，以期为获得高纯度 Ⅱ 型丙酮酸激酶以及将其应用于ATP合成与ATP再生系统等研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

表达载体pET28a由合肥工业大学生物与食品工程学院保存；大肠杆菌菌株DH5α、BL21（DE3）、TOP10购自Invitrogen公司；限制性内切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ、碱性磷酸酶（CIAP）、高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver 2.1购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；SanPrep柱式质粒DNA提取试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚类分析。

在NCBI数据库中检索丙酮酸激酶并获得相应的丙酮酸激酶氨基酸序列。这些序列包括了17个细菌、真菌及多细胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通过MEGA7软件，分析了丙酮酸激酶氨基酸序列的同源性，并进行聚类制图。

1.2.2 pET28a-pykA的构建。

根据大肠杆菌pykA基因（GenBank编号为NZ_CP017979）编码区的DNA序列上、下游为同源臂设计扩增引物，上、下游引物分别为5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-CCCGCTCGA GTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTG-3′。引物两端引入了限制性酶切位点Xho Ⅰ与BamH Ⅰ。通过聚合物链式反应（PCR），以大肠杆菌基因组DNA为模板扩增pykA基因，反应使用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，利用限制性内切酶Xho Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切消化，与表达载体pET28a连接，转化TOP10感受态细胞，利用抗性平板（卡那霉素）筛选阳性克隆。

菌落PCR筛选阳性菌落的PCR反应使用Taq DNA聚合酶，所用引物分别为5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。提取PCR鉴定的阳性菌株质粒进行Bgl Ⅱ 酶切鉴定。将酶切鉴定符合预期的质粒，命名为pET28apykA，送样进行DNA测序。然后把序列正确的重组载体pET28apykA转化进大肠杆菌BL21细胞，即得到 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的表达宿主。

1.2.3 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。

挑取BL21/pET28apykA单克隆过夜培养。过夜菌液按1∶100接种于1 L LB培养基中，37 ℃振荡培养2 h至对数生长中期，OD600为0.6。加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，22 ℃振荡培养过夜。

1.2.4 蛋白纯化。

将表达PykA蛋白的1 L菌液5 000 r/min离心20 min，收集细菌沉淀。用30 mL Solution I（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl）重懸菌体，加入苯甲基磺酰氟（PMSF），用超声波破碎细胞（工作时间5 s，暂停时间5 s，功率50%，总时间30 min），4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清，采用Ni亲和层析柱纯化 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。用Solution Ⅰ 充分平衡Ni亲和层析柱，粗蛋白溶液上样后，用Solution Ⅱ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑）洗脱杂蛋白，用Solution Ⅲ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脱，收集洗脱峰，通过SDSPAGE电泳分析目的蛋白纯度。蛋白洗脱液共7.5 mL，用截留分子量为10 kDa的半透膜和透析液Solution Ⅳ（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5% Glycerol，5 mmol/L MgCl2）进行透析。用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质浓度进行测定。

1.2.5 HPLC鉴定蛋白活性。

PykA酶活性检测在1 mL缓冲溶液中进行（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L Na2SO4，10 mmol/L MgCl2，0.05 mg/mL PykA，5 mmol/L PEP-K+，5 mmol/L ADP），30 ℃水浴锅中反应1 h，并进行HPLC检测。色谱柱为YMC-Pack Polya mine Ⅱ；洗脱液A为去离子水，洗脱液B为1 mol/L KH2PO4；反应产物用1 mol/L KH2PO4溶液进行梯度洗脱；在254 nm紫外波长处检测洗脱峰。

2 结果与分析

2.1 进化分析

从NCBI数据库中检索了17个细菌、真菌及多细胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通过MEGA 7软件，用最大似然法进行分析。由图1可知，丙酮酸激酶的氨基酸序列保守，能够反映物种进化规律。大肠杆菌的丙酮酸激酶PykF、PykA与其他细菌，如德氏乳杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌的氨基酸序列同源性更高，体现了更近的亲缘关系。

2.2 pET28a-pykA的构建

以大肠杆菌基因组DNA为模板，用PCR方法扩增得到了丙酮酸激酶基因。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA片段大小与电泳结果相符（图2）。用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。用限制性内切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ分别对pykA基因和载体pET28a进行限制性酶切、连接并转化到TOP10感受态细胞中。挑取7个单克隆进行菌落PCR检验，菌落PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。如图3a所示，1～7号泳道均检测出单一条带，根据电泳的DNA片段大小，显示了这7个克隆均为阳性克隆。为了进一步验证该阳性克隆，又用SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒提取了1个阳性菌株的质粒，并进行了Bgl Ⅱ 限制性酶切鉴定。如图3b所示，酶切后的琼脂糖凝胶电泳显示2条DNA条带，大小与预期（5 964和814 bp）相符。菌落PCR与酶切检验均正确的质粒送样测序，DNA测序结果正确，克隆的基因中未发生碱基突变。

2.3 蛋白表達与纯化

经过菌落PCR、酶切及DNA测序均显示正确的表达质粒，转化到大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导过夜。取诱导前后的菌，细胞破碎后通过SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达情况。结果如图4a所示，泳道1显示未诱导细菌的总蛋白，泳道2为诱导细菌的总蛋白。结果显示诱导后在55 kDa附近有较明显的蛋白条带，与 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白分子量大小一致。为了得到纯化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白，利用镍柱进行蛋白纯化。如图4b所示，泳道1为纯化前的细菌蛋白粗液，泳道2为纯化后的蛋白，纯化后的蛋白只有1条目的蛋白条带，纯化效果很好。利用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒对纯化后的目的蛋白PykA进行定量，蛋白浓度为2 mg/mL，共从1 L培养液中获得20 mg纯化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。

2.4 HPLC鉴定PykA酶活

丙酮酸激酶催化ADP生成ATP。为了 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的活性，在1 mL缓冲溶液中进行了酶促催化反应，以ADP为底物，在30 ℃水浴锅中反应1 h后，用高压液相色谱进行检测。图5a显示了AMP、ADP、ATP标准品的保留时间分别为19、32、48 min。取PykA催化ADP生成ATP的反应混合物，过滤样品后通过HPLC进行了检测。结果见图5b，反应1 h后，反应混合物中ATP占97.9%，ADP含量降至2.1%以下，表明在 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的催化作用下，有97.9%的ADP被转化生成ATP。

3 结论

构建了大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的原核表达载体pET28-pykA，并在宿主大肠杆菌BL21中实现了高效表达。经过Ni亲和层析柱纯化得到高纯度的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。该酶可以在1 h内将5 mmol/L ADP转化为ATP，转化效率为97.9%，显示了大肠杆菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的良好催化能力。该工作为ATP酶法合成及ATP再生系统等后续研究提供了理论依据。

参考文献

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