加拿大蓝靛果忍冬组培快繁技术研究

姜思佳 焦丽 韩曦 赵利群 李滨胜 崔杰

摘要 [目的]研究加拿大蓝靛果忍冬组培快繁技术。[方法]以黑龙江省森林植物园选育的加拿大蓝靛果忍冬优良品种J-12的叶芽、花芽、茎段、叶片为外植体进行组培试验。通过在MS培养基上附加不同激素配比，筛选出最佳外植体和最佳培养基配方。[结果]叶芽为最佳诱导外植体。最佳消毒时间组合为75%乙醇10 s与2% NaClO 4 min，污染率低至2%。J-12蓝靛果忍冬品种诱导叶芽分化及增殖的最佳培养基及激素配比是MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，增殖倍数最高可达8.0倍；最佳生根培养基为1/2MS+IBA 050 mg/L+NAA0.20 mg/L，生根率为100.00%。[结论]该研究可为加拿大蓝靛果忍冬的大规模生产提供技术支持。

关键词 蓝靛果忍冬；组织培养；分化

中图分类号 S663.9 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2017）29-0155-02

A Preliminary Study of Tissue Culture Technique of Canadas Lonicera edulis

JIANG Sijia1，JIAO Li1，HAN Xi1，CUI Jie2* et al

（1.Heilongjiang Forest Botanical Garden，Harbin，Heilongjiang 150040；2.Harbin Institute of Technology，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To study the tissue culture technique of Canadas Lonicera edulis.[Method] The leaf buds，flower buds，stem segments and leaves of the fine strain J-12 which were selected by Heilongjiang Forest Botanical Garden were used in tissue culture test.The best explants and best media formulations were selected by adding different hormone ratios on MS medium.[Result] Leaf buds were the best induced explants.The optimal disinfection time combination was 75% alcohol 10 s and 2% NaClO 4 min，and the pollution rate was low to 2%.The optimal medium for leaf bud differentiation and proliferation of the J-12 was MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，with a maximum multiplication factor of up to 8.0 times.The best rooting medium was 1/2 MS+IBA0.50 mg/L+NAA 0.20 mg/L，the rooting rate was 100.00%.[Conclusion] The study provided technical support for the largescale production of Canadas Lonicera edulis.

Key words Lonicera edulis；Tissue culture；Differentiation

基金項目 黑龍江省财政林业科技推广示范资金项目“蓝靛果忍冬优良品种繁育及栽培技术推广与示范”（〔2015〕ST-11号）。

作者简介 姜思佳（1985—），女，黑龙江哈尔滨人，工程师，硕士，从事林木培育、种质资源引种与保存研究。*通讯作者，副教授，博士，从事基因工程应用研究。

收稿日期 2017-08-16

蓝靛果忍冬（Lonicera edulis）又名蓝靛果、羊奶子、山茄子，是忍冬科忍冬属多年生落叶小灌木[1]，果实具有很高的营养价值，抗氧化物质含量较高[2-8]，是提取食用天然色素的良好资源[9-10]，既可生食又可加工成浆果产品，蓝靛果忍冬还可作为观赏树种[11]，主要分布在我国东北地区、内蒙古及华北等地区[12-13]以及俄罗斯远东地区、日本、朝鲜北部。

我国开展蓝靛果忍冬的研究起步比较晚，野生资源日益枯竭，优良品种培育进展缓慢，引进的大部分品种主要来自俄罗斯。目前关于蓝靛果忍冬组培快繁技术的研究已经取得一些进展。Ding等[14]、Jin等[15]对外植体消毒和最佳诱导培养基进行筛选；梁琦兰等[16]利用嫩枝茎段诱导成功；李桂君等[17]成功诱导出俄罗斯耐寒蓝靛果忍冬组培苗。该试验所使用植物材料是从加拿大引进的优良品种，目前国内对其组培技术的研究鲜见报道。该研究以黑龙江省森林植物园选育出的优良品种J-12为材料进行组织培养试验，将组培快繁技术研究与培育新品种相结合，有助于提高幼苗繁殖效率、加速育种进程、保护和合理利用蓝靛果忍冬种质资源以及优良品种的示范推广。

1 材料与方法

1.1 材料 试验材料为黑龙江森林植物园选育的加拿大蓝靛果忍冬优良品种J-12。组培试验在哈尔滨工业大学食品研究院进行。

1.2 外植体的获得和消毒

12月份采集蓝靛果忍冬优良品种J-12的冬眠枝条，用自来水清洗，除去表面灰尘，然后进行水培。开始阶段，每3 d更换1次清水，萌芽后每5 d更换1次清水。

將长出的叶芽、花芽、茎段、叶片作为组织培养的试验材料，取试验材料放入自来水下冲洗30 min，在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗3次，然后用70%乙醇溶液表面消毒10 s，取出后用无菌蒸馏水冲洗3次，再用2%NaClO溶液消毒2～10 min，无菌蒸馏水冲洗3次，最后放在无菌滤纸上将多余的水分吸干，以降低污染率和减少玻璃化情况的发生，筛选出最佳的时间组合。

1.3 最佳诱导培养基的筛选

以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（1.00、1.50、2.00 mg/L）和NAA（0.10、0.15、0.20 mg/L），采用2因素3水平正交设计，每个处理重复3次，每次重复接种25瓶。接种后放入培养箱，16 h/d光照，光照强度为2 000 lx，箱内温度调节在（25±2）℃，湿度70%～80%。每天观察培养物情况，30 d后统计不同处理方式的诱导率，并观察记录其生长状况。

1.4 最佳生根培养基的筛选

将诱导出的丛生不定芽切成高2.5～3.0 cm的若干单株，接入1/2MS、1/2MS+IBA 1.00 mg/L+NAA 0.20 mg/L、1/2MS+IBA0.50 mg/L+NAA 0.20 mg/L 这3种生根培养基中。经过30 d培养，统计各生根培养基中试管苗的生根率。

1.5 炼苗及移栽

将试管苗的封口膜除去，室温（25～30 ℃）下遮阳炼苗3～5 d，然后从瓶内取出试管苗，轻轻洗除试管苗根部的琼脂，移栽到经过高锰酸钾消毒的基质中，空气湿度保持在80%以上。

1.6 统计分析 采用Excsl 2007和SPSS 12.0软件进行数据分析与处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间效果

采用75%乙醇和2%NaClO组合进行消毒试验，其中乙醇消毒时间为10 s，NaClO消毒时间设置为2、4、6、8、10 min。试验结果表明接种材料的最佳消毒方式是用无菌水冲洗3次，后用75%乙醇消毒10 s，再用无菌水冲洗3次，再用2%NaClO消毒4 min，最后用无菌水冲洗3次，平均污染率低至2%（表1）。

2.2 不同外植体的筛选

外植体分别为水培后的叶芽、花芽、茎段、叶片（5 mm×5 mm），采用完全随机分组试验，每种材料接种25瓶，重复3次。由表2可知，叶芽和茎段的分化率较高，分别为93.33%、50.67%，而花芽和叶片的分化率均为0，叶芽为最佳外植体。

2.3 不同激素浓度对外植体分化的影响 将蓝靛果忍冬J-12外植体叶芽接种于诱导培养基上，7 d后叶芽开始萌动，并逐渐伸长，15 d后芽长到1.0～1.5 cm，30 d后芽高平均达3.0 cm，呈嫩绿色。不同浓度NAA、6-BA激素配比对蓝靛果忍冬J-12叶芽诱导率以及增殖倍数有极显著的影响（表3）。多重比较结果表明，蓝靛果忍冬外植体在5号培养基中诱导率最高，达97%。NAA的3个水平中，0.15 mg/L的增殖倍数最大；6-BA的3个水平中，1.50 mg/L的增殖倍数最大。确定蓝靛果忍冬J-12诱导叶芽分化及增殖的最佳培养基及激素配比是MS +NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.50 mg/L，增殖倍數可达8.0倍。

2.4 最佳生根培养基的筛选

将诱导出的丛生不定芽切成高2.5～3.0 cm的若干单株，接入生根培养基中进行诱导生根。培养到20 d左右时，试管苗开始长根。接种到1～3号生根培养基上的试管苗均能长出白色的根，但根的数量和长度存在显著差异。由表4可知，3号生根培养基生根效果最好，培养到30 d左右时，生根率达100.00%，平均根长8.3 cm，此时试管苗健壮，可进行炼苗。

2.5 移栽基质的选择

准备3种移栽基质：细沙、草炭土 ∶细沙=2 ∶1、珍珠岩。试管苗经炼苗后，分别栽入3种基质中。栽培35 d后统计试 管苗的成活率及苗高。由表5可知，不同移栽基质对试管苗的成活率和苗高都有显著影响。试管苗在细沙基质中成活率达80%；在草炭土+细沙的混合基质中成活率达92%，苗高最高（10.80 cm）；在珍珠岩基质中成活率较低（44%），可见最佳移栽基质为草炭土 ∶细沙=2 ∶1。

3 结论

（1）加拿大蓝靛果忍冬优良品种J-12的叶芽为最佳诱导外植体。

（2）最佳消毒时间组合为75%乙醇10 s与2%NaClO 4 min，污染率低至2%。

（3）诱导叶芽分化及增殖的最佳培养基及激素配比是MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，增殖倍数最高可达8.0倍。

（4）最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.50 mg/L+NAA0.20 mg/L，生根率为100.00%。

（5）最佳移栽基质为草炭土 ∶细沙=2 ∶1，成活率达92%。

参考文献

[1]

王秀锁，孙秀殿，白艳春.蓝靛果的利用及栽培[J].特种经济动植物，2002（6）：34.

[2] 王宏涛，叶云，肖顺林，等.蓝靛果乙酸乙酯提取物对胃溃疡大鼠胃黏膜血管活性物质的影响[J].辽宁中医杂志，2007，34（3）：360-361.

[3] WANG H，CAO G H，PRIOR R L.Total antioxidant capacity of fruits[J].Journal of agricultural and food chemistry，1996，44（3）：701-705.

[4] WANG S Y，BOWMAN L，DING M.Methyl jasmonate enhances antioxidant activity and flavonoid content in blackberries （Rubus sp.） and promotes antiproliferation of human cancer cells [J].Food chemistry，2008，107（3）：1261-1269.

[5] 马自超.蓝锭果（Lonicera caerulea）中的花青素色素的研究[J].中国野生植物资源，1996（2）：1-5.

[6] 王燕兰，沈卓群，姚贵良，等.兰锭果天然食用红色素[J].中国野生植物，1990（4）：1-13.

[7] 戚向阳，彭光华.兰锭果色素的特性研究[J].湖北农业科学，2003（1）：70-73.

[8] 向延菊，王大偉. 蓝靛果忍冬的研究利用现状及其发展前景[J].塔里木农垦大学学报，2004，16（4）：26-29.

[9] 古丽江·许库尔汗.俄罗斯的蓝靛果忍冬品种[J].落叶果树，2012，44（1）：62-65.

[10] 兰士波，罗旭，李谞.蓝靛果忍冬研究进展及开发应用前景[J].中国林副特产，2008（1）：87-90.

[11] 周以良.黑龙江植物志[M].哈尔滨：东北林业大学出版社，1998：76.

[12] 黄普华，邵忠文，卓丽环.我国东北地区蓝靛果初步研究[J].国土与自然资源研究，1982（1）：57-62.

[13] 李恒，邢桂菊，廉美丹.药用植物——蓝靛果[J].中国林副特产，2002（1）：10.

[14] DING M，FENG R，WANG S Y，et al.Cyanidin3glucoside，a natural product derived from blackbery， exhibits chemopreventive and chemotherapeutic activity[J].Joumal of biological chemistry， 2006，281：17359-17368.

[15] JIN C，CAO H N，ZONG C W，et al.Research on tissue culture and rapid propagation technology of superior individuals of Lonicera edulis Turcz.[J].Agricultural science & technology，2011，12（11）：1585-1588.

[16] 梁琦兰，张启昌，杨振国，等.蓝靛果忍冬芽體组织培养技术研究[J].北华大学学报（自然科学版），2006， 7（6）：549-551.

[17] 李桂君，李艳霞，卢慧颖，等.俄罗斯耐寒蓝靛果忍冬组织培养技术研究[J].林业科技， 2012，37（4）：219-220.