响应面法优化水酶法提取碧根果油的研究

王静 张友青 陈燕茹

摘要 [目的]利用响应面法优化水酶法提取碧根果油的工艺。[方法]以碧根果为原料，在单因素试验的基础上，选取料液比、酶添加量和pH为响应因子，采用3因素3水平的响应面分析，建立数学模型，并得出水酶法提取碧根果油的最佳工艺条件。[结果]确定水酶法提取碧根果油的最佳工艺参数如下：烘烤温度120 ℃，料液比1∶8（g∶mL）、碱性蛋白酶添加量2.05%、pH 12.15，酶解时间1.5 h，在此条件下碧根果油实际提取率为82.24%，与模型预测值相一致。[结论]该研究可为碧根果的综合利用提供理论依据。

關键词 碧根果油；提取率；水酶法；响应面分析

中图分类号 TS225.1+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0078-03

Abstract [Objective] The aqueous enzymatic extraction process of pecan oil was optimized by response surface methodology.[Method]Taking pecan as experiment material，based on singlefactor experiments，ratio of solid to liquid，enzyme amount and pH were chosen as the response factors，and extraction rate of oil was chosen as the response value.The mathematical model was established by the response surface analysis implemented by three factors and three levels，and the optimum technological conditions for extracting pecan oil were obtained.[Result]The optimal conditions were as follows：baking temperature 120 ℃，ratio of solid to liquid 1∶8（g∶mL），enzyme amount 2.05%，pH 12.15 and enzymolysis time 1.5 h.Under the above conditions，the actual extraction rate of oil was 82.24%，in agreement with the value predicted by the mathematical model.[Conclusion]The study can provide reference basis for comprehensive utilization of pecan.

Key words Pecan oil；Extraction rate；Aqueous enzymatic extraction；Response surface analysis

碧根果又名美国山核桃[Carya illinoensis （Wangenh.） K.Koch]、薄壳山核桃、长寿果，属胡桃科山核桃属，原产北美大陆的美国和墨西哥北部，是世界著名的优质干果[1-2]。碧根果果壳薄，出仁率高，果仁肥厚味美、无涩味，不仅可以鲜食还可榨取高级食用油和制作糕点、冰激凌等，其营养成分及风味均优于核桃、山核桃[3]。

水酶法主要在利用物理方式破碎的基础上，通过酶（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、维生素酶等）的降解作用释放细胞壁中包裹的油脂，然后利用非油成分对油和水的亲和力差异将非油成分和油分离。与原始提取技术比较，水酶法具有绿色安全、投资少、能耗低、废弃物易于利用和处理等优点，在油脂工业中应用前景十分广阔[4-5]。李杨等[6]利用Alcalase 碱性蛋白酶提取松子油，总油提取率可达89.12%。李静等[7]利用碱性蛋白酶提取牡丹籽中的油脂，出油率为23.25%。笔者采用碱性蛋白酶提取碧根果油，利用响应面设计优化工艺参数，旨在获得一种绿色安全且提取率高的碧根果油提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料 供试碧根果采自浙江杭州余杭长乐林场。主要试剂：碱性蛋白酶（2×105 U/g），最适温度45～55 ℃，最适pH 9.00～13.00，购自北京奥星博化学试剂有限公司； 其他试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：HWS-28型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；PHSJ-3F酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；CT14RD高速冷冻离心机，上海天美科学仪器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水酶法提取碧根果油工艺流程。准确称取10.00 g碧根果仁，在一定温度下烘烤0.5 h，粉碎，加入一定体积的蒸馏水，充分混匀，调节pH，加入一定量的碱性蛋白酶，置于50 ℃恒温水浴锅内酶解。酶解结束后，将温度迅速升至100 ℃灭酶10 min，在4 200 r/min转速下离心20 min，收集上层游离油脂，弃去乳状液及水解液，用50 mL蒸馏水将残渣洗涤，混匀，再次离心，收集上层游离油，将2次离心所得的游离油脂合并称重，计算提取率。

提取率=（碧根果油质量/碧根果脂肪含量）×100%

1.2.2 碧根果油脂肪含量测定方法。参照GB 5009.6—2016酸水解法测定。

1.2.3 碱性蛋白酶提取碧根果油的单因素及响应面试验。分析烘烤温度、酶解时间、料液比、酶添加量、酶解pH 5个因素对碧根果油提取率的影响。在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken中心组合试验，利用Design Expert 8.0进行响应面分析，以获得最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 烘烤温度对碧根果油提取率的影响。在酶解时间1.0 h，料液比1∶7（g∶mL），酶添加量为2.00%，酶解pH为12.00的条件下，分析不同烘烤温度对碧根果油提取率的影响，结果见图1。由图1可知，碧根果油提取率随烘烤温度升高快速上升，当温度达到120 ℃后，碧根果油提取率增长缓慢。因此确定水酶法提取碧根果油的最佳烘烤温度为120 ℃。

2.1.2 酶解时间对碧根果油提取率的影响。在烘烤温度为120 ℃，料液比1∶7（g∶mL），酶添加量为2.00%，酶解pH为12.00的条件下，分析不同酶解时间对碧根果油提取率的影响，结果见图2。由图2可知，随着酶解时间的增加，碧根果油提取率呈快速上升趋势，当酶解时间达到1.5 h时，提取率达到最大值，为69.16%；但当酶解时间超过1.5 h后，提取率呈缓慢增长趋势。这可能是碱性蛋白酶与底物的反应逐渐趋于完全的原因。随着时间的延长，碧根果油中不饱和脂肪酸极易发生氧化，且生产成本也会增加，因此综合考虑，确定最佳酶解时间为1.5 h。

2.1.3 料液比对碧根果油提取率的影响。在烘烤温度为120 ℃，在酶解时间1.5 h，酶添加量为2.00%，酶解pH为12.00的条件下，分析不同料液比对碧根果油提取率的影响，结果见图3。由图3可知，碧根果油的提取率随着料液比中溶剂用量的增加快速上升，当料液比中溶剂用量超过1∶8（g∶mL）后，提取率呈现下降趋势。当料液比中溶剂用量过低时，碧根果仁中大量油脂、蛋白质导致碧根果仁浆料黏度较大，碱性蛋白酶与底物没有完全接触，不利于酶解的进行。当料液比中溶剂用量过高，酶反应体系中的酶浓度和底物浓度则会变得相对较低，影响碱性蛋白酶的反应速率[8]。因此，确定最佳的料液比为1∶8（g/mL）。

2.1.4 酶添加量对碧根果油提取率的影响。在烘烤温度为120 ℃，料液比1∶8（g∶mL），在酶解时间1.5 h，酶解pH为12.00的条件下，分析不同酶添加量对碧根果油提取率的影响，结果见图4。由图4可知，随着碱性蛋白酶添加量的增加，碧根果油的提取率呈先上升后下降趋势，当碱性蛋白酶的添加量增加到2.00%时，提取率达到最大值，为81.24%。可能是由于过多的碱性蛋白酶会吸附在被粉碎的碧根果仁表面，使得油脂被包裹在其中无法释放[9]。因此确定最佳的碱性蛋白酶添加量为2.00%。

2.1.5 酶解pH对碧根果油提取率的影响。在烘烤温度为120 ℃，料液比1∶8（g∶mL），酶解时间1.5 h，酶添加量为2.00%的条件下，分析不同酶解pH对碧根果油提取率的影响，结果见图5。由图5可知，随着酶解pH的升高，碧根果油的提取率呈先上升后下降趋势，酶解pH达到12.00时，碧根果油的提取率达到最大值，为81.21%。低酶解pH时，碧根果油提取率较低，可能是因为低pH环境中碱性蛋白酶的活性较弱，随着酶解pH的上升，酶活增强，碧根果油的提取率开始逐渐增加。当酶解pH继续增加，碱性蛋白酶逐渐失去活性，酶解效果减弱，导致碧根果油提取率下降。因此，确定最佳酶解pH为12.00。

2.2 响应面分析法优化提取工艺

2.2.1 响应面试验设计及结果。

结合单因素试验结果，选定烘烤温度为120 ℃，酶解时间1.5 h，以料液比（A）、酶添加量（B）、酶解pH（C）3个因素作为响应变量，碧根果油提取率为响应值，采用3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验优化工艺参数，具体因素和水平设计见表1，试验设计方案和结果见表2。

2.2.2 模型的建立及显著性分析。运用Design-Expert 8.0得到碧根果油提取率（Y）对自变量料液比（A）、酶添加量（B）、酶解时间pH（C）的二次多项回归模型：Y=80.59+0.76A-0.60B+3.58C+0.03AB-5.75AC+9.77BC-2.64A2-7.27B2-14.20C2。

其中F回归=87.24>F0.01（9，4）=14.66；P值<0.000 1，表明模型极显著。F失拟项=0.560.05，表明失拟不显著。该模型的修正相关系数R2Adj=0.979 8，说明模型能解释97.98%的响应值变化。综上所述，该模型的可信度和拟合度均很高，因此可用该模型回归方程预测水酶法提取碧根果油的工艺条件。此外，pH的一次项、交互项、二次项、料液比和酶添加量的二次项均达到极显著水平（P<0.01）。

2.2.3 响应面分析與最优工艺条件确定。响应面分析及优化模型中A、B、C交互作用对响应值碧根果油提取率的影响如图6、7、8所示。该组图反映3个因素中任何2因素交互影响碧根果油提取率的效果。从图6～8可以看出，提取率在试验区域内存在最大值，它随着2个因素值的不断升高而升高，达到最大值后又逐渐下降。

再对三维非线性回归模型进行求一阶偏导，并令其为零，得出提取率最优的条件：A=0.00，B=0.10，C=0.15，转化为实际参数，即料液比为1∶8（g∶mL），酶添加量为2.05%，pH为12.15，在此条件下碧根果油的提取率为80.84%，验证值为82.24%，两者相对偏差为0.86%<5%，说明该模型能够较好地预测实际碧根果油提取率情况。

3 结论

该试验选用Alcalase 碱性蛋白酶提取碧根果油，在单因素试验的基础上，选用料液比、酶添加量和pH作为研究对象，通过3因素3水平的Box-Behnken响应面法优化水酶法提取碧根果油最佳工藝条件，即烘烤温度120 ℃，料液比为

1∶8（g∶mL），酶添加量为2.05%，pH为12.15，酶解时间1.5 h。

在此条件下，碧根果油的提取率可达到82.24%，与预测结果基本一致。

参考文献

[1]贾晓东，王涛，张计育，等.美国山核桃的研究进展[J].中国农学通报，2012，28（4）：74-78.

[2] 朱海军，生静雅，张普娟，等.贮藏温度对薄壳山核桃抗氧化功能及品质的影响[J].江苏农业学报，2015，31（2）：449-453.

[3] 吴国良，张凌云，潘秋红，等.美国山核桃及其品种性状研究进展[J].果树学报，2003，20（5）：404-409.

[4] BARRIOS V A，OLMOS D A，NOYOLA R A，et al.Optimization of an enzymatic process for coconut oil extraction[J].Oleagineux，1990，45（1）：35-42.

[5] 荣辉，吴兵兵，杨贤庆，等.水酶法提取生物油脂的研究进展[J].食品工业科技，2017，38（2）：374-378.

[6] 李杨，江连洲，王胜男，等.响应面法优化水酶法提取松子油的研究[J].中国粮油学报，2012，27（3）：60-65.

[7] 李静，姚茂君，李俊，等.响应面法优化牡丹籽油的水酶法提取工艺[J].中国油脂，2014，39（10）：14-18.

[8] 宋玉卿，于殿宇，王谨，等.水酶法提取榛子油工艺条件研究[J].食品科学，2008，29（8）：261-264.

[9] 包怡红，郭阳.响应面试验优化超声波辅助水酶法提取松籽油工艺及其氧化稳定性[J].食品科学，2016，37（22）：60-68.