9种植物精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病的抑菌活性

贾会玲　黄晓德　钱骅　朱羽尧　陈斌　韩双双　赵伯涛

摘要[目的]研究9种植物精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病的抑菌活性。[方法]采用滤纸片法和试管梯度稀释法测定了9种精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病的抑菌活性。[结果]与阳性对照福美双相比，异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油对黄瓜枯萎病的抑制作用较强，抑菌圈直径分别达（32.0±0.3）和（20.4±0.2）mm。异硫氰酸丙烯酯对黄瓜枯萎病的最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MFC）均为0.049 μL/mL，肉桂精油对黄瓜枯萎病菌的MIC和MFC均为0.098 μL/mL，其余精油及精油单体的抑菌效果较弱。[结论]异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油对黄瓜枯萎病的抑菌活性较好，具有进一步研究的价值。

关键词植物精油；精油单体成分；黄瓜枯萎病；抑菌活性

中图分类号S436.421.1+3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0160-03

Abstract[Objective] The antifungal activity of nine essential oils and essential oil monomers was tested against Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum. [Method] The antifungal activity of nine essential oils and essential oil monomers was studied by using filter paperresearch and broth dilution method. [Result] The inhibition zone of allyl isothiocyanate and cinnamon essential oil on Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum were （32.0±0.3） and （20.4±0.2） mm， respectively， compared with the positive control. The minimal inhibitory concentration （MIC） and the minimal fungicidal concentration （MFC） on Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum of the allyl isothiocyanate were both 0049 μL/mL， and the MIC and MFC on Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum of the cinnamon oil were both 0.098 μL/mL. Their antifungal effect was close to thiram. But the inhibition effects of the rest of essential oils and essential oil monomers were weaker. [Conclusion] Allyl isothiocyanate and cinnamon essential oil had better antifungal effects， which was important to further research and develop.

Key wordsEssential oil；Essential oil monomers；Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum；Antifungal activities

黄瓜枯萎病是一种严重的土传病害，其病原菌为半知菌亚门镰孢属的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum），引起的植物枯萎病在十大植物真菌病害中排在第5位[1]，是影響黄瓜生产的主要病害之一。病菌从幼根或伤口侵入，大量繁殖后，堵塞黄瓜木质部导管，阻碍水分沿着导管向地上部运输，使植株迅速萎蔫且病势发展迅速，很难控制。我国流行的菌系为生理小种4号[2]，常年发病率在10%～30%，重病年份在80%～90%[3]，使黄瓜大幅减产，严重影响了黄瓜生产。农业生产上常用多菌灵、恶霉灵、代森锰锌等杀菌剂来防治黄瓜枯萎病。但化学农药的防治易造成环境污染、农药残留等问题，所以采用安全、高效、环境友好型生物防治成为最佳选择。

植物精油是一类植物源次生代谢物质，其分子量较小，可随水蒸气蒸出并且具有一定挥发性的油状液体[4]，具有杀菌、防腐、杀虫等生物活性。有关植物精油、精油单体成分抑制植物病原菌的研究很多[5-10]。因植物精油及精油单体成分来源于天然，在环境中可以被完全降解，不会产生残留，对人体相对安全，是一种环境友好型杀菌成分。其用途十分广泛，具有广阔的开发前景。笔者主要以黄瓜枯萎病菌为供试菌，对植物精油及精油单体成分的抑菌活性进行了初步研究，以期为植物精油及精油单体成分在农药领域的开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试精油及精油单体成分。丁香精油、孜然精油、牛至精油由南京野生植物综合利用研究院植物资源与化学研究室通过蒸馏提取获得；肉桂精油购自于宏芳香料（昆山）有限公司；98%异硫氰酸丙烯酯、100%丁香酚、95%枯茗醛、95%香芹酚和100%百里香酚购自于广州汉佰斯日化科技发展有限公司。

1.1.2供试菌种。植物病原真菌：黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）由南京农业大学资源与环境学院郭世伟教授提供。

1.1.3培养基。马铃薯蔗糖固体培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然，分装于250 mL三角瓶中，121 ℃湿热灭菌20 min。马铃薯蔗糖液体培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然，分装于250 mL三角瓶中，121 ℃湿热灭菌20 min。

1.1.4仪器与试剂。KDM 1 000 mL恒温电热器（上海苏进仪器设备厂）、电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、IKA涡旋振荡器（深圳市科力易翔仪器设备有限公司）、HG75-4电热恒温两用培养箱（南京实验仪器厂）、HZQ-F160全温度振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、超净工作台（苏州净化设备厂）、50%福美双可湿性粉剂（山东罗邦生物农药有限公司）和二甲基亚砜（国药集团化学试剂有限公司，AR）。

1.2方法

1.2.1抑菌圈法（滤纸片法）测定[11-12]植物精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病原菌的抑制作用。将供试植物精油及精油单体成分用二甲基亚砜（DMSO）配制成体积浓度为50 μL/mL，称取10 mg福美双溶解于1 mL二甲基亚砜中，制成有效浓度为5 mg/mL的福美双溶液备用。用无菌接种环刮取少量黄瓜枯萎病菌种于无菌马铃薯蔗糖液体培养基中，在28 ℃恒温摇床中培养48 h，然后用无菌液体培养基制成浓度为1×106～1×107 cfu/mL的菌悬液，备用。按照无菌操作的方法，将融化的无菌马铃薯蔗糖固体培养基倾入灭菌培养皿中待凝固后，加入100 μL菌悬液涂布均匀，一段时间后用无菌镊子夹取已经灭过菌的6 mm无菌圆形滤纸片，每片滤纸片滴加5 μL抑菌剂贴在固体平板上，每个培养皿贴3片，每组做3个平行对照，以含DMSO滤纸片的培养基作为空白对照，福美双作为阳性对照，将培养皿放入28 ℃恒温培养箱中培养，48 h后观察测量，取3组平行对照的测量值并计算抑菌圈直径平均值，测量结果中包括滤纸片直径（6 mm）。

1.2.2最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MFC）的测定。对于经过滤纸片法初筛得到的具有较好抑菌活性的植物精油及精油单体成分，采用试管二倍稀释法[13]测定其最小抑菌浓度。用DMSO将植物精油及精油单体成分稀释成不同浓度梯度的稀释液，每支试管分别加入100 μL 1×105～1×106 cfu/mL制备好的菌悬液，设立对照组：阴性对照组只含液体培养基和菌液，不含精油或精油单体成分。阳性对照组除含液体培养基和菌液外，每管再加入福美双。将试管置于28 ℃恒温摇床中培养48 h，每处理设置2个平行对照，3次重复。按照文献方法[14]判定最小抑菌浓度：观察试验组、对照组的浑浊情况，以判断不同浓度的精油及精油单体成分的抑菌作用。试验组如试管内呈浑浊，表明有菌生长，用“+”表示；如试管内透明清亮，表明无菌生长，用“-”表示。试管中呈清亮透明的精油或精油单体成分的最小浓度为其最小抑菌浓度。

最小杀菌浓度的测定[15]：将0.1 mL精油或精油单体成分有效抑菌浓度药液移至空白的马铃薯固体培养基上涂布均匀，将培养皿置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察培养基上有无菌物生长，以培养皿中计数减少原始菌落的99.9%的精油或精油单体成分的浓度作为最小杀菌浓度。最小抑菌浓度与最小杀菌浓度可能相同，也可能不同[16]。

1.2.3数据处理。采用Microsoft Excel 2010对数据进行处理，利用SPSS软件中ANOVA 方法对试验数据进行方差分析，并用Duncans 新复极差法比较数据之间的差异显著性。

2结果与分析

2.1抑菌圈测定结果

由表1可知，9种供试抑菌剂中除了枯茗醛和孜然精油外，其他精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病菌都有一定的抑菌效果。其中，异硫氰酸丙烯酯对黄瓜枯萎病的抑菌活性最强，抑菌圈直径达（32.0±0.3）mm，且抑菌圈大小显著高于阳性对照福美双（有效浓度为5 mg/mL，下同）；肉桂精油對黄瓜枯萎病也有较好的抑菌效果，抑菌圈直径为（20.4±0.2）mm，仅次于异硫氰酸丙烯酯，抑菌作用与福美双相当；牛至精油、香芹酚和百里香酚对黄瓜枯萎病的抑制效果差距不大，但抑菌圈大小低于阳性对照福美双；丁香酚与丁香精油的抑制黄瓜枯萎病的作用较差，抑菌圈直径分别为（10.3±0.1）和（8.3±0.1）mm，抑菌效果远低于阳性对照。各抑菌剂的抑菌效果从大到小依次为异硫氰酸丙烯酯、肉桂精油、百里香酚、香芹酚、牛至精油、丁香酚、丁香精油。

2.2最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）

通过滤纸片法初筛得到抑菌效果较好的抑菌剂，测定其MIC与MFC。由表2可知，异硫氰酸丙烯酯对黄瓜枯萎病的MIC和MFC最小，均为0.049 μL/mL。其次，肉桂精油对黄瓜枯萎病的MIC、MFC都是0.098 μL/mL，以上2种抑菌剂对测试菌种的MIC、MFC与阳性对照福美双的MIC、MFC比较接近。其他抑菌剂的MIC、MFC较大，供试菌种的MFC为MIC的2～4倍。异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油的MIC、MFC均小于01 μL/mL，说明两者在较低浓度下对黄瓜枯萎病菌具有较好的杀菌效果。该MIC和MFC与“2.1”的抑菌效果相一致。

3结论与讨论

该研究通过测定9种精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，发现除了孜然精油和枯茗醛外，剩余的精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病均具有不同程度的抑菌效果。抑制黄瓜枯萎病菌作用最强的是异硫氰酸丙烯酯，且抑菌效果强于阳性对照福美双（有效浓度5 mg/mL）。其次是肉桂精油，对黄瓜枯萎病的抑制作用较强，抑菌效果与福美双相当。其余精油及精油单体成分对黄瓜枯萎病的抑制作用较差，抑菌效果均低于福美双。在最小抑菌浓度与最小杀菌浓度试验中，异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油的MIC、MFC均在0.1 μL/mL以下，其他精油及精油单体成分的MIC、MFC均大于0.1 μL/mL，进一步表明异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油具有较强的抗黄瓜枯萎病原真菌的作用。异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油是天然调味料中的主要成分，是可食用的原料，开发生物农药，具有安全环保优势。

随着对农产品质量安全和环境保护认识的提高，研究利用植物精油用于植物有害生物的防治报道越来越多[17-19]。异硫氰酸丙烯酯、肉桂精油的杀菌活性已有报道：异硫氰酸丙烯酯对禾本科植物上赤霉菌等真菌具有较好的抑菌活性[10]，对6种辣椒土传病原菌菌丝生长也均具有强烈的抑制作用[20]；肉桂精油对番茄茎枯病菌和苹果青霉病菌等多种重要的果蔬病害致病真菌的菌丝生长具有较强的抑制作用[21]。在该试验中，异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油对黄瓜枯萎病的菌丝生长具有很好的抑制作用，尤其是异硫氰酸丙烯酯具有较强的挥发性，对黄瓜枯萎病的菌絲生长具有很强的抑制效果，预期如作为土壤熏蒸剂，能很好地控制由尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌等引起的常见土传病害。

植物精油的活性与其结构密切相关，具有酚、酸和醛、酮类成分的精油大部分都具有抑菌活性，肉桂精油中的主要成分为肉桂醛，百里香酚为百里香精油的主要成分，香芹酚主要存在于牛至精油中，而丁香酚为丁香精油的主要成分，这些精油都表现有较强的抑菌活性[22]；异硫氰酸酯类物质分子内拥有—NCS共轭双键结构，具有活拨的化学性质[23]。该试验中，异硫氰酸丙烯酯和肉桂精油对黄瓜枯萎病菌活性较强，推测黄瓜枯萎病菌异硫氰酸丙烯酯中的共轭双键—NCS和肉桂精油中的肉桂醛对黄瓜枯萎病菌作用比较敏感，而百里香酚、香芹酚与丁香酚等酚类物质对黄瓜枯萎病菌不敏感，因而未表现出很好的抗枯萎病菌活性。出现上述现象可能由抑菌成分本身的结构决定，也可能受试验方法的影响，具体的抑菌机制还不清楚，有待进一步研究。

植物精油无论是单种植物精油还是其单体成分都具有良好的抑菌活性。另外，许多植物精油具有多重生物活性，既具有杀虫活性，也具有抑菌活性。植物精油的这些特点为其开发利用提供了有利条件[17]。我国的肉桂产量占世界肉桂产量的80%以上，这就为肉桂精油的开发应用提供了良好的基础条件[24]；山葵及芥子等调味料中的异硫氰酸丙烯酯类成分可以人工合成，价格低廉。可见，异硫氰酸丙烯酯、肉桂精油具有较好的抗黄瓜枯萎病原菌的开发利用价值，作为农用杀菌剂应用具有广阔前景[25]。

该试验对于黄瓜枯萎病菌的抑制作用只是着眼于对菌丝的抑制效果，有关精油及精油单体成分对其孢子萌发的影响、抑菌作用方式、在活体植物上的防病效果以及对其他植物病原菌的抑菌效果，还有待进一步研究。另外，因植物精油及精油单体成分有很强的挥发性，需找到一种较好的稳定剂作为其载体，使之制剂化，更好地应用到农业中，也有待于后续研究。

安徽农业科学2017年

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