六堡茶中金花菌的分离与鉴定

欧惠算　邓旭铭　张灵枝　张均伟　马士成　邱瑞瑾

摘要：【目的】研究鉴定六堡茶中的金花菌，为推动六堡茶产业发展提供一定的理论基础。【方法】采用平板涂布法及三点接种法从梧州中茶茶厂2015年11月生产的六堡茶中分离纯化金花菌，以传统的形态学观察法观察菌落特征，利用光学显微镜观察菌丝、分生孢子等结构特征，再结合分子生物学方法对分离获得的菌株进行DNA序列分析，并通过ITS序列进行同源性搜索比对和系统发育进化树分析。【结果】分离获得一株金花菌，命名为LB-1。LB-1菌株的形态特征与散囊菌属很相似，主要表现为：菌落呈金黄色、有同心环、有放射性脊等，其ITS序列与阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）的同源性达99%，进一步确定LB-1菌株为阿姆斯特丹散囊菌。【结论】从六堡茶中分离获得的金花菌LB-1为散囊菌属中的阿姆斯特丹散囊菌。在六堡茶加工中，可为LB-1菌提供适宜的环境，促进其大量繁殖，以增强六堡茶的保健功效。

关键词： 六堡茶；金花菌；阿姆斯特丹散囊菌；分离；鉴定

中图分类号： S571.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0658-05

Abstract：【Objective】Jinhua fungus in Liupao tea was identified in order to provide theoretical basis for Liupao tea industry development. 【Method】Spread-plate method and three-point inoculation method were adopted to isolate and purify Jinhua fungus from Liupao tea produced by China Tea（Wuzhou） Factory in November， 2015. The colony characteristics were observed by traditional morphology observation method， and the structures like hypha and conidium were observed via optical microscope. Then DNA sequence analysis for strain isolated was conducted combining molecular biology method， and homology searching and comparison via ITS sequence and phylogenetic tree analysis were carried out. 【Result】One strain of Jinhua fungus was isolated and named LB-1. The morphological characteristics of LB-1were similar to those of Eurotium： golden colony， concentric rings， radioactive ridge， etc. The homology of its ITS sequence to Eurotium amstelodamiwas 99%. Therefore， LB-1 was identified as E. amstelodami. 【Conclusion】Jinhua fungus LB-1 is isolated from Liupao tea， and identified as E. amstelodami in Eurotium. During processing of Liupao tea， the producers can create suitable environment for LB-1 and promote the mass reproduction of LB-1， so as to enhance the health care effects of Liupao tea.

Key words： Liupao tea； Jinhua fungus； Eurotium amstelodami； isolation； identification

0 引言

【研究意义】六堡茶因原产于广西梧州市苍梧县六堡乡而得名，属于黑茶类，为后发酵茶。六堡茶特殊的加工工艺：杀青—初揉—堆闷—复揉—干燥—筛选—拼配—渥堆—初蒸焗堆—复蒸—凉置—陈化（DB45/T 479-2014），使其具有独特的品质特征：干茶色泽黑褐光润，汤色红浓似琥珀，滋味醇和甘爽，润滑可口，有槟榔味，叶底红褐色，耐冲泡，以“红、浓、陈、醇”四绝著称，耐于久藏，越陈越好（何志强，2007）。近年来，以普洱茶为代表的黑茶类在市场上掀起了热潮，黑茶中微生物鉴定也成为海内外学者研究的热点，出现了大量关于茯砖茶中金花菌的研究报道，如陈椽（1984）提出，金花菌能够分泌淀粉酶催化茶叶中的淀粉转化为单糖，还可分泌氧化酶催化多酚类化合物氧化，从而消除茶叶枝梗的粗老气味，使茶汤呈红棕色，滋味也更加醇厚并带有甜味；杨抚林（2005）在体外模拟胃液的试验中发现金花菌发酵液对胃蛋白酶活性有促进作用，但对脂肪酶活性有抑制作用；邓放明等（2007）研究发现黑茶中的金花菌具有降脂、减肥、促进消化、改善人体肠道的功效，其发酵产物胞外多糖还具有抑制肿瘤的功效。人们通常根据金花菌的质量和数量来判断茯砖茶品质的好坏，因此，研究六堡茶金花菌，对改善六堡茶的加工工艺、促进六堡茶产业发展具有重要意义。【前人研究进展】黑茶中的微生物种类繁多且对茶叶的影响较大。近年来，关于金花菌的鉴定研究较多并已取得较大进展。黄浩等（2010）从湖南益阳茶厂2008年生产的金湘益砖茶中分离纯化得到一株金花菌，在光学显微镜下观察菌株形态、在扫描电镜下观察菌株的子囊孢子（有性阶段）和分子孢子（无性阶段），同时结合DNA测序，在分子水平上对分离菌株进行鉴定，确定该菌株为冠突散囊菌。彭晓赟等（2011）对湖南地区茯砖茶上金花菌的菌落特征和形态特征进行了研究，并运用扫描电镜观察了其子囊孢子和分生孢子的发育过程，鉴定其为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。宋伟（2011）从黑砖茶中分离纯化获得5种真菌，经过形态学观察及分子鉴定确定5种真菌分别为：塔宾曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、斑点青霉、冠突散囊菌和泡盛曲霉，其中的阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）和冠突散囊菌屬于金花菌。徐书泽（2014）利用高通量测序技术对梧州茶厂4个成品六堡茶中的真菌多样性和菌落结构进行分析，通过传统形态学鉴定结合真菌分子鉴定技术从中分离鉴定得到5个属18个种的微生物，其中的散囊菌属为阿姆斯特丹散囊菌。胡谢馨等（2016）从茯砖茶中分离出一株优势菌株LS1，经形态学观察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鉴定为冠突散囊菌。【本研究切入点】前人对黑茶类金花菌的研究主要集中在普洱茶和茯砖茶上，对广西六堡茶金花菌的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用平板涂布法从梧州中茶茶厂2015年产的六堡茶中分离金花菌，采用三点接种法对分离获得的金花菌进行培养，探索适宜其生长的培养基，通过运用光学显微镜观察菌落形态、参照真菌鉴定手册及结合现代分子生物学进行DNA测序，从分子水平上对六堡茶金花菌进行鉴定，为揭示六堡茶的安全性、提高六堡茶的品质及促进六堡茶产业的发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试茶样：2015年11月刚压好的六堡茶（梧州中茶茶厂提供）。培养基：分离纯化培养基（PDA培养基）、鉴定培养基（察氏琼脂培养基、20%蔗糖察氏琼脂培养基）。

1. 2 六堡茶金花菌分离与纯化

分离：称量10 g茶样于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL无菌蒸馏水，于振荡器中振荡15 min，即制成10-1倍的稀释菌悬液；在超净工作台上吸取1 mL的10-1菌悬液加入到装有9 mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的稀释菌悬液，以此类推，依次稀释至10-7。分别取1 mL各稀释浓度的菌悬液在PDA培养基上，用无菌三角玻璃棒划“十”和“（）”的手法均匀涂布，每个浓度设3个重复，于恒温培养箱内28 ℃倒置培养7 d。

纯化：用针挑取少许金黄色菌丝，用划线法在PDA和察氏培养基上进行多次分离培养，直至菌落的形态相同，将得到的金花用试管斜面培养基培养后保存于4 ℃冰箱中。

1. 3 金花菌形态学观察

将4 ℃保存的菌种取出，于28 ℃下活化培养24 h，用三点接种法分别将菌株接种于察氏琼脂培养基和20%蔗糖察氏琼脂培养基上，于28 ℃恒温培养箱倒置培养，每天观察、记录菌落的生长情况。

采用插片法，将灭菌的盖玻片呈45～50°角插入20%蔗糖察氏琼脂培养基，待菌丝扩展至盖玻片，取出将其放在载玻片上（粘有菌丝的一面朝上），在光学显微镜下观察并拍照记录。

1. 4 金花菌分子鉴定

菌株DNA提取：用划线法培养菌株6 d后，用已灭菌小铁铲将菌丝刮下置于已灭菌的研钵中，加入液氮迅速将菌丝研磨成粉末，按照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒的说明进行操作。

PCR扩增引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAG

GAAGTAA-3'）；ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3'）。PCR反应体系25.0 μL：DNA模板1.5 μL，ExTaq酶（TaKaRa公司）12.5 μL，IFS1F引物0.5 μL，IFS4引物0.5 μL，加无菌水至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统拍照。将PCR纯化产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将得到的序列在NCBI数据库中使用BLASTn进行同源序列比对，通过MEGA 6.0构建系统发育进化树。选用邻位相连法（Neighbor-joining）构建进化树，用自展检验（Bootstrap）方法进行验证，随机搜索设置为1000。

2 结果与分析

2. 1 金花菌的形态学特征

从六堡茶中分离纯化得到一株金花菌，命名为LB-1。采用三点法分别将LB-1菌株接种到察氏琼脂培养基和20%蔗糖察氏琼脂培养基上，结果显示，菌落在察氏琼脂培养基上生长缓慢，但在20%蔗糖察氏琼脂培养基上生长较快，其生长速度为75 mm/14 d。菌落为绒状，中间微隆起，整体呈金黄色，有同心环纹路，中间部位较边沿更黄，黄色闭囊壳丰富，成熟后为黄褐色，菌落中心部位有长放射性脊，菌丝有隔，呈不对称分枝，培养5 d左右其上分布暗灰绿色的分生孢子头，分生孢子梗茎较长，分生孢子串生，为球形或近球形，大小为4.5～4.9 μm，表面粗糙，培养7 d左右，有大量成熟的分生孢子脱落在菌丝周围（图1、图2）；菌落背面呈棕褐色，老后颜色变深，无脊光滑（图1-b）。根据对金花菌菌落及光镜的观察结果，结合中国真菌志（齐祖同，1997），初步将LB-1菌株鉴定为散囊菌属。

2. 2 金花菌的分子生物学鉴定

将PCR扩增测序得到的ITS序列（图3）在NCBI数据库中使用BLASTn进行同源性搜索比对，结果（表1）发现，在比对列表中居前十幾位相似度在97%以上的可培养菌株均为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami），比对相似性均达99%，如将序列相似性在97%以上的基因克隆子定义为同一种物质，则分离的金花菌为阿姆斯特丹散囊菌。再进一步应用MEGA 6.0构建系统发育进化树，结果（图4）显示，分离出的LB-1菌株与阿姆斯特丹散囊菌连在同一分支上，因此进一步确定LB-1菌株为阿姆斯特丹散囊菌。

3 讨论

金花菌是茯砖茶的代表，人们常以金花菌的多少来衡量茯砖茶品质的好坏。黄浩等（2010）根据茯砖茶中金花菌株的表观形态、光学显微镜、扫描电镜特征和DNA序列分析，确认茯砖茶中的金花菌为冠突散囊菌（E. cristatum）。而胡治远等（2011）通过分离比较不同茯砖茶中的优势菌，得到15株散囊菌属、8株冠突散囊菌、2株肋状散囊菌、3株谢瓦散囊菌、1株蜡叶散囊菌和1株阿姆斯特丹散囊菌，说明茯砖茶中的金花菌具有多样性。六堡茶经过渥堆和陈化，形成了独特的品质特征，具有槟榔香味，并以金花普遍茂盛品质为佳。本研究在六堡茶中分离得到的金花菌经鉴定为阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。毛彦等（2013）在梧州六堡茶中也分离得到一株金花菌，通过群体形态和个体形态研究，参照真菌分类鉴定手册和序列同源性搜索比对，鉴定出六堡茶的金花菌为雪黄散囊菌；而陈然等（2016）选取多家梧州六堡茶龙头企业生产的六堡茶产品进行真菌分析，结果得出不同厂家六堡茶产品的优势菌种包括冠突散囊菌和谢瓦氏散囊菌等散囊菌属真菌。以上两个研究与本研究鉴定结果不一致，可能是由于试验茶样来自不同茶厂，在加工时沤堆的时间和温度不同，导致成品茶中的金花菌种不同。可见，六堡茶中的金花菌也具有多样性。

散囊菌属是黑茶中的一类重要真菌，其对黑茶的品质口感、保健功效均有举足轻重的作用。刘作易和秦京（1991）的研究结果表明，冠突散囊菌丝体富含15种氨基酸，其中包括所有的必需氨基酸。此外，有多篇文献报道冠突散囊菌的抗氧化活性、抑菌效果及其对消化酶活性的影响等研究（杨抚林，2005；黄群等，2007a，2007b；李瑩，2014；葛永怡等，2015）。本课题组下一步将对分离鉴定出的阿姆斯特丹散囊菌进行更深入研究，探究其对六堡茶品质的影响，以及六堡茶抗氧化、促消化和降血脂等效果的作用机理，以期为六堡茶的生产加工、利用和发展打下一定的理论基础。

4 结论

本研究在新生产的六堡茶中分离纯化得到一株金花菌（LB-1菌株），运用光学显微镜观察菌落的形态、参照真菌鉴定手册并结合现代分子生物学进行DNA测序，通过ITS序列进行同源性搜索比对和系统发育进化树分析，确认LB-1菌株为阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。在六堡茶加工中，可为LB-1菌提供适宜的环境，促进其大量繁殖，以增强六堡茶的保健功效。

参考文献：

陈椽. 1984. 制茶技术理论[M]. 上海：上海科学技术出版社.

Chen C. 1984. Theory of Tea Processing Technique[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press.

陈然，郝彬秀，田海霞，李颂，马跃，王春玲. 2016. 六堡茶真菌分布浅析及金花菌筛选鉴定[J]. 食品科技，41（4）：19-23.

Chen R，Hao B X，Tian H X，Li S，Ma Y，Wang C L. 2016. Distribution of fungal strains and molecular identification of Eurotium cristatum in Liupao tea[J]. Food Science and Technology， 41（4）：19-23.

邓放明，龚淑莉，杨伟丽. 2007. 冠突散囊菌胞外多糖生物活性高通量筛选试验[J]. 食品与机械， 23（6）： 48-51.

Deng F M，Gong S L，Yang W L. 2007. Study on bioactivity of extra cellular polysaccharide of Eurotium cristatum by high through putscreening[J]. Food & Machinery， 23（6）： 48-51.

葛永怡，吴石平，谭玉梅，刘永翔，刘作易. 2015. 冠突散囊菌不同生长阶段MAT基因的表达量变化[J]. 西南农业学报，28（6）：2730-2735.

Ge Y Y，Wu S P，Tan Y M，Liu Y X，Liu Z Y. 2015. Expression difference of mating type gene in different development stages of Eurotium cristatum[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（6）：2730-2735.

何志强. 2007. 弘扬六堡茶文化 做强六堡茶产业[J]. 中国茶叶，（4）： 32-38.

He Z Q. 2007. Carrying forward the Liupu tea culture and strengthening Liupu tea industry[J]. China Tea，（4）： 32-38.

胡谢馨，易有金，柏连阳，李高阳，周红丽，周金伟，夏菠. 2016. 茯砖茶“金花”菌的分离、鉴定及转化葛根产物研究[J]. 茶叶科学，36（3）：268-276.

Hu X X，Yi Y J，Bo L Y，Li G Y，Zhou H L，Zhou J W，Xia B. 2016. Research on separation， identification and transformation products transformed kudzu root of ‘Jinhua fungus[J]. Journal of Tea Science， 36（3）：268-276.

胡治远，赵运林，刘素纯，刘石泉，龙立平，彭晓赟，李燕子. 2011. 不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定[J]. 江西农业学报， 23（12）： 60-64.

Hu Z Y，Zhao Y L，Liu S C，Liu S Q，Long L P，Peng X Y，Li Y Z. 2011. Isolation and identification of dominant microorganisms from different kinds of Fu-brick tea[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，23（12）： 60-64.

黄浩，刘仲华，黄建安，李适，李娟，吴杨，邓婷婷，龚雪. 2010. “发花”散茶中“金花”菌的分离鉴定[J]. 茶叶科学，30（5）： 350-354.

Huang H，Liu Z H，Huang J A，Li S，Li J，Wu Y，Deng T T，Gong X. 2010. Isolation and identification of “Jinhua” fungi from the loose tea with “Fungus Growing”[J]. Journal of Tea Science，30（5）： 350-354.

黄群，陈林杰，李彦坡，车科. 2007a. 冠突散囊菌黑茶发酵液对消化酶活性影响的研究[J]. 微生物学通报，（5）： 917-920.

Huang Q，Chen L J，Li Y P，Che K. 2007a. Study on the effect of dark tea fermentation liquid with Eurotium cristatum on the activity of digestive enzyme[J]. Microbiology，（5）： 917-920.

黃群，李彦坡，陈林杰，车科. 2007b. 冠突散囊菌液态发酵过程中黑茶活性成分变化研究[J]. 食品科学，28（12）： 231-234.

Huang Q， Li Y P，Chen L J， Che K. 2007b. Study on changes of active components in dark tea during liquid fermentation by Eurotium cristatum[J]. Food Science，28（12）： 231-234.

李莹. 2014. 冠突散囊菌化学成分及其抗氧化活性研究[D]. 北京： 北京中医药大学.

Li Y. 2014. Study the chemical composition and its antioxidantactivity on Eurotium cristatum[D]. Beijing：Beijing University of Chinese Medicine.

刘作易，秦京. 1991. “金花”菌与茯砖茶品质[J]. 贵州农学院学报，10（1）：79-82.

Liu Z Y，Qin J. 1991. “Jinhua” fungus and Fu-brick tea quality[J]. Journal of Guizhou Agricultural School，10（1）：79-82.

毛彦，黄丽，韦保耀，夏宁，滕建文. 2013. 广西六堡茶“金花”菌的分离与分子鉴定[J]. 茶叶科学，33（6）： 556-561.

Mao Y，Huang L，Wei B Y，Xia N，Teng J W. 2013. Isolation and molecular identification of fungal colonization on LiuPao tea in Guangxi[J]. Journal of Tea Science，33（6）： 556-561.

彭晓赟，章卫民，刘淑云，雷存喜，周小梅，刘石泉，赵运林. 2011. 湖南地区茯砖茶中金花菌的分离鉴定[J]. 菌物研究， 9（3）：157-161.

Peng X Y，Zhang W M，Liu S Y，Lei C X，Zhou X M，Liu S Q，Zhao Y L. 2011. Isolation and identification of “Golden Flower” fungus in Fuzhuan tea from Hunan area[J]. Journal of Fungal Research， 9（3）：157-161.

齐祖同. 1997. 中国真菌志（第五卷） 曲霉及相关有性型[M]. 北京： 科学出版社.

Qi Z T. 1997. Flora Fungorum Sinicorum（VolumeⅤ）： Aspergillus and Related Teleomorph[M]. Beijing：Science Press.

宋伟. 2011. 黑砖茶真菌的分离鉴定及功能研究[D]. 长沙：湖南农业大学.

Song W. 2011. Research on isolation，identification and function of funguses in duck brick tea[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.

徐书泽. 2014. 六堡茶中真菌的多样性分析[D]. 南宁：广西大学.

Xu S Z. 2014. Fungal community analysis of Liu Pao tea[D].Nanning：Guangxi University.

杨抚林. 2005. 冠突散囊菌液体发酵工艺及其发酵液对消化酶活性影响的研究[D]. 长沙：湖南农业大学.

Yang F L. 2005. Studies on liquid fermentation technology of Eurotium cristatum and the effects of the fermentative liquor on digestive enzyme activities[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.

（责任编辑 麻小燕）