核桃青皮总酚含量测定和抗氧化能力研究

魏欢 杨建文 颜小捷 卢凤来

摘要 [目的]测定核桃青皮80%乙醇提取物及其经大孔树脂HP-20分段后的各纯化部分的总酚含量，评价其各部分的抗氧化能力，并分析总酚含量与抗氧化能力的关系。[方法]采用福林-酚比色法，测定总酚含量，通过DPPH·和ABTS·自由基清除法评价其抗氧化能力。[结果]核桃青皮提取物及其各纯化部分均表现出一定的抗氧化性，其中Fr.2（20%甲醇洗脱部分）、Fr.3（40%甲醇洗脱部分）部分的IC50 （半数抑制浓度）均高于VC （抗坏血酸），Fr.4 （60%甲醇洗脱部分）和Ext.（80%乙醇提物部分）与VC相当，并且总酚含量和抗氧化能力呈正相关。[结论]经过大孔树脂HP-20处理后的核桃青皮乙醇提取物，其总酚的含量得到了富集，为进一步研究核桃青皮各部分的物质成分提供了依据。同时表明核桃青皮的提取物可以作为天然的抗氧化剂应用于食品、医疗、化妆品、保健品等行业。

关键词 核桃青皮；总酚；含量测定；抗氧化

中图分类号 S664.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0121-03

Determination of Total Phenols Content and Antioxidant Capacity of Walnut Green Husks

WEI Huan1，2，YANG Jian-wen1*，YAN Xiao-jie2 et al （1.Guilin University of Technology，Guilin，Guangxi 541006； 2.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，Guilin，Guangxi 541006）

Abstract [Objective]To determine the content of total phenols in the 80% ethanol extracts of walnut green husk and its several purification sections isolated and purified by HP-20，evaluate the antioxidant capacity of the extracts，and analyze the relationship between the content of polyphenols and antioxidant capacity.[Method]The content of total phenolswere determined by the method of Folin-phenol，and its extract antioxidant capacities were compared by DPPH· and ABTS· radical scavenging.[Result]All the extracts showed antioxidant activity，in which the IC50（half maximal inhibitory concentration） value of Fr.2（the elution fraction of 20% methanol ） and Fr.3（the elution fraction of 40% methanol） was better than that of VC（ascorbic acid），Fr.4（the elution fraction of 60% methanol ） and Ext.（the extract portion of 80% ethanol） was similar to VC，and polyphenol content and antioxidant capacity was positive correlation.[Conclusion]The content of polyphenols in the ethanol extract of walnut green husk can be enriched by HP-20，which will provide a basis for the further study of the material composition of the walnut green husk.The extract of walnut green husk can be used as a natural antioxidant used in food，health care，cosmetics，health products and other industries.

Key words Walnut green husk；Total phenols；Content detemination；Antioxidant

核桃青皮又称青龙衣，为核桃未成熟季节其外部的一层厚厚的绿色果皮，味辛、苦，性涩、平。核桃成熟期间，大量青皮作为垃圾堆放于田间、地头或沟边，造成环境污染。如果对核桃青皮中的有效物质加以综合利用，不仅可以保护环境，还可以增加果农收入[1]。核桃青皮具有抑菌、杀虫、解毒、抗肿瘤功效[2]。目前，国内外学者对核桃青皮化学成分进行了研究，从中提取分离鉴定所得化合物，主要有黄酮、萘醌、二芳基庚烷、萜、甾体、多酚、脂肪酸及多糖等多类化合物[3-6]。多酚是多羟基分类的总称，在核桃青皮中的含量仅次于黄酮、蒽醌类，具有很强的抑菌、抗氧化性、抗肿瘤、抗衰老等功效，其抗癌机理也与其抗氧化性息息相关[7]。多酚的测量方法常见的有分光光度法、薄层层析法、高锰酸钾滴定法、福林-酚（Folin-Ciocalteu）比色法、香草醛盐酸法、气液色谱法、比色法等，其中Folin-Ciocalteu比色法操作简单、化学干扰少、重现性和稳定性高，灵敏度和选择性高，应用也最为广泛[8]。然而对于如何提高核桃青皮中總酚的提取率和测定总酚的含量，及总酚含量与抗氧化性的关系等缺乏系统的研究。大孔吸附树脂是一种常用的分离纯化多酚物质的方法，由于该技术成本低廉、选择性好、效率高、毒性小等优点而具备很好的应用前景[9-10]。笔者通过大孔吸附树脂HP-20对核桃青皮粗提物进行预处理，建立一个测定核桃青皮中总酚含量的方法，并测定核桃青皮粗提物和各纯化部分对DPPH·和ABTS·自由基的清除能力，评价其抗氧化能力[11]，以期为有效开发利用核桃青皮提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。JA2003N 电子天平（上海菁海仪器有限公司）；电子天平XS225A -SCS（Precisa）； FN101-2A 鼓风干燥箱（长沙仪器仪表厂）；R-200型旋转蒸发仪（BuchiLabortechnik AG CH-9230） ；SHZ - D（Ⅲ） 循环水式真空泵（巩义市英予华仪器厂）；HH- S型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.1.2 试剂。

无水乙醇（AR，西陇化工股份有限公司，批号110601） ；无水碳酸钠（AR，广州化学试剂厂，批号830902）；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所）；福林酚试剂（GOLDWHEAT）；纯净水；其他试剂均为分析纯。2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，美国Sigma公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma 公司）；抗坏血酸（VC，中国药品生物制品检定所）。

1.1.3 样品。

新鲜的核桃青皮于2015年8月购买于广西壮族自治区河池市凤山县。用80%乙醇浸泡提取7 d，连续提取3次。凭证标本保存于广西植物功能物质研究与利用重点实验室。

1.2 方法

1.2.1 总酚含量测定方法。有关对照品溶液的配置以及标准曲线的建立见参考文献[12-14]。以没食子酸为标准品，采用稍加改进的Folin-Ciocalteu比色法测定其总酚的含量。Folin-Ciocalteu 比色法的原理是Folin-Ciocalteu试剂中的钨钼酸可以将试样品中的总酚化合物定量氧化，同时自身被还原呈现蓝色并生成蓝色化合物，颜色的深浅与试样样品中总酚含量关系密切，以标准品为对照建立标准曲线，通过测定不同样品反应后的吸光度，根据标准曲线即可得到被测样品的总酚含量。此方法多用于食品或植物中多酚类物质的测定。

1.2.2 供试样品溶液的配制。

核桃青皮80%乙醇提取物干浸膏300 g，经HP-20大孔树脂处理，依次用水以及20%、40%、60%、80%、100%甲醇洗脫（各梯度均洗脱到无色为止）浓缩干燥，得到各纯化部分。分别精密称取Fr.1（水洗部分）、Fr.2（20%甲醇洗脱部分）、Fr.3（40%甲醇洗脱部分）、Fr.4（60%甲醇洗脱部分）、Fr.5（80%甲醇洗脱部分）、Fr.6（100%甲醇洗脱部分）干浸膏、Ext.（核桃青皮80%乙醇粗提物）20 mg，各加入50%乙醇溶解超声，转移至100 mL容量瓶中，定容到刻度，摇匀，备用。分别精确吸取上述供试样品0.1 mL，按“1.2.1”显色方法显色，测得各部分样品吸光度。

1.2.3 对照品VC溶液的配制。具体方法同“1.2.2”。

1.2.4 抗氧化能力测定。测定方法参考[15-17]，稍作改动。

1.2.4.1 DPPH·自由基清除能力。

在同样的浓度条件下，经过DPPH·自由基检测，吸光度越小说明样品的清除能力越强，采用80%乙醇溶液分别配制提取物及各部分一系列不同质量浓度的样品溶液（0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.00、1.50 mg/mL）。精密移去0.5 mL的样品溶液于PE试管中，再加入0.5 mL DPPH·乙醇溶液（0.394 g/L）混匀（空白组用溶剂代替样品溶液，对照组用溶剂代替DPPH·溶液），在37 ℃下避光水浴反应30 min，在室温条件下测定517 nm 的吸光度。按照以上相同的方法以抗坏血酸（VC）作阳性对照，按照以下公式计算DPPH·清除率，并计算提取物及各部分样品的半清除率质量浓度（IC50）。

DPPH·清除率=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%式中，A空白为0.5 mL DPPH·溶液与0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度，A样品为样品溶液的吸光度，A对照为0.5 mL样品溶液和0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

1.2.4.2 ABTS·自由基清除能力。

采用80%乙醇溶液分别配制提取物及各部分一系列不同质量浓度的样品溶液（0、12.5、25.0、37.5、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0 μg/mL），精密移取0.2 mL样品溶液，再加入1 mL ABTS·溶液，混匀（空白组用溶剂代替样品溶液，对照组用溶剂代替ABTS·溶液），在室温下避光反应30 min，测定734 nm下的吸光度。按照以上相同的方法以抗坏血酸（VC）作阳性对照，按照以下公式计算ABTS·清除率，并计算提取物及各部分样品的半清除率质量浓度（IC50）。

ABTS·清除率=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%式中，A空白为1.0 mL ABTS·溶液与0.2 mL 80%乙醇溶液的吸光度，A样品为样品溶液的吸光度，A对照为0.2 mL样品溶液和1.0 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮中总酚含量的测定

2.1.1 没食子酸标准曲线。

以没食子酸为标准品建立的标准曲线为y=14.339 0x+0.003 7（R2=0.999 4），表明没食子酸在0～0.036 mg范围内与吸光度具有良好的线性关系（图1）。

方法学考察显示，精密度试验中计算得到的RSD为0.047%，说明该仪器精密度良好；稳定性试验中计算得到的RSD为0.18%，表明该样品在显色后210 min内稳定性良好；重现性试验中计算得到的RSD为0.56%，表明该方法重现性良好；加样回收率试验中，得到样品的平均回收率为99.46%，RSD为0.96%，表明该方法具有较高的准确性。

2.1.2 核桃青皮的总提取物及各纯化部分的总酚含量测定。由表1可知，经过HP-20大孔树脂对核桃青皮提取物干浸膏样品进行预处理，单从其得率来看，效果较好，总回收率达到95.46%。预处理所得的样品中，总酚含量从高到低依次为Fr.3、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1。说明经过大孔树脂HP-20预处理后，核桃青皮中多酚类物质得到了很好的富集。

2.2 抗氧化能力测定

2.2.1 DPPH·自由基清除能力。

由表1～2可知，在同一质量浓度范围内，样品的总酚含量与DPPH·清除能力具有明显的量效关系。提取物及各部分样品对DPPH·的清除能力从大到小依次为Fr.3、Fr.2、Fr.4、VC、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1，Fr.3、Fr.2、Fr.4的清除能力强于对照VC，Fr.5的清除能力与VC相当，Fr.6和Fr.1的清除能力比VC弱。

2.2.2 ABTS·自由基清除能力。由表1～2可知，在同一质量浓度范围内，样品的总酚含量与ABTS·清除能力具有很明显的量效关系。提取物及各部分样品对ABTS·自由基的清除能力从大到小依次为Fr.3、Fr.2、VC、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1，Fr.3、Fr.2的清除能力比VC强，Fr.4、Fr.5的清除能力与VC相当，而Fr.1和Fr.6的清除能力比VC弱。

3 结论

福林-酚比色法具有良好的稳定性和可靠性，可用于测定核桃青皮和各部分总酚含量。经过HP-20大孔树脂对核桃青皮提取物干浸膏样品进行预处理，单从其得率来看，效果较好，总回收率达95.46%。预处理所得的样品中，总酚含量从高到低依次为Fr.3、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1。说明经过大孔树脂HP-20预处理后，核桃青皮中多酚类物质得到了很好的富集，通过DPPH·和ABTS·自由基清除试验表明核桃青皮粗提物及其各纯化部分均具有一定的抗氧化能力，而且经过大孔树脂HP-20的预处理后，Fr.2、Fr.3和Fr.4部分的抗氧化能力明显增强，甚至超过VC的抗氧化能力。试验结果表明，核桃青皮粗提物与各纯化部分的抗氧化能力与其总酚的含量呈正相关。该研究可以为进一步开发利用核桃資源以及其抑菌、杀虫、抗氧化、抗肿瘤等生物方面的活性研究提供依据，也为更进一步深入研究核桃青皮中活性成分的提取、分离和结构鉴定提供理论基础。

参考文献

[1] 图尔贡江·伊力亚则，孙宇，倪慧，等.核桃青皮的研究进展[J].中国现代中药，2015，17（1）：77-81.

[2] 翟梅枝，晏婷，王元，等.胡桃属植物青皮和叶的化学成分及其生物活性研究进展 [J].西北植物学报，2011，31（10）：2133-2138.

[3] 周媛媛，刘雨新，孟颖，等.青龙衣中的醌类成分研究 [J].中医药学报，2015（3）：8-10.

[4] 沈广志，邹桂华，梁婷，等.核桃楸的化学成分研究进展 [J].中国实验方剂学杂志，2015（17）：219-224.

[5] 黄成钢，阎新佳，邹晓祺，等.青龙衣的化学成分和抗肿瘤活性研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2014（5）：517-521.

[6] 周媛媛，刘兆熙，孟颖，等.青龙衣乙酸乙酯部位的化学成分研究[J].中医药信息，2015，32（3）：20-22.

[7] 张世珍，高兴盛，冉翠香，等.核桃青皮中多元酚类化合物的提取及含量分析 [J].南方农业，2014，8（30）：159-162.

[8] 朱霞，李焕荣，罗游.Folin-Ciocalteu比色法测定核桃青皮中多酚含量条件的优化 [J].食品与机械，2014（4）：122-125.

[9] 张春梅，陈朝银，赵声兰，等.大孔吸附树脂纯化核桃内种皮总多酚的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（17）：27-30.

[10] PARKIN D M，FERNNDEZ L M.Use of statistics to assess the global burden of breast cancer [J].Breast journal，2006，12（S1）：70-80.

[11] 梁杏，张旭，陈朝银，等.核桃饼粕多酚纯化工艺及其抗氧化活性的研究[J].中国酿造，2015，34（4）：55-61.

[12] 颜小捷，谷陟欣，卢凤来，等.FOLIN-酚比色法测定裸花紫珠中总酚含量 [J].中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：74-78.

[13] 王亚凤，黄永林，刘金磊，等.壳斗科植物种子的多酚类含量及抗氧化能力 [J].广西科学，2016，23（2）：180-183.

[14] 刘春丽，颜小捷，杨子明，等.龙眼果皮及果核中植物多酚含量的测定及抗氧化能力研究 [J].食品科技，2014（11）：203-206.

[15] 朱霞，李焕荣，罗游.Folin-Ciocalteu比色法测定核桃青皮中多酚含量条件的优化 [J].食品与机械，2014（4）：122-125.

[16] WANG R J，WANG S，XIA Y J，et al.Antitumor effects and immune regulation activities of a purified polysaccharide extracted from Juglan regia[J].International journal of biological macromolecules，2015，72：771-775.

[17] 关小丽，黄永林，刘春丽，等.荔枝皮化学成分的研究（Ⅰ） [J].广西植物，2014，34（2）：151-154.