美洲大蠊蛋白质的提取工艺优化及其对伤口愈合的影响

王涛 邹玉 孙小英 王魁源 许龙 罗志文 吕冬云

摘要 [目的]优化美洲大蠊蛋白质的提取方法，并研究美洲大蠊蛋白质对小鼠伤口愈合的影响。[方法]采用碱提法、盐提法和酶提法对美洲大蠊蛋白质进行分离和提取，测定不同方法提取美洲大蠊蛋白质的含量，优化美洲大蠊蛋白质的提取工艺；并用提取的美洲大蠊蛋白质进行小鼠伤口愈合试验，研究美洲大蠊蛋白质对小鼠伤口愈合的影响。[结果]在碱浓度为1.5%、提取温度为80 ℃、提取时间为1.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高；在盐浓度为1.0%、提取温度为40 ℃、提取时间为2.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高；在酶占样本比为0.6%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高。小鼠伤口愈合试验表明，美洲大蠊提取的蛋白质可以促进伤口愈合，且愈合时间比正常情况下缩短近一半。[结论]碱液浓度、盐浓度和酶浓度对美洲大蠊蛋白质提取的影响最大。3种方法提取美洲大蠊蛋白质的效果从大到小依次为酶提法、碱提法、盐提法，即美洲大蠊蛋白质提取的最优方法为胰蛋白酶提取法。美洲大蠊蛋白质对小鼠伤口愈合有促进作用。

关键词 美洲大蠊；蛋白质；提取工艺；伤口愈合

中图分类号 R282.74 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0124-04

Optimization of Extraction Process of Periplaneta americana Protein and Its Effect on Wound Healing

WANG Tao， ZOU Yu， SUN Xiao-ying，L Dong-yun* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract [Objective] To optimize extraction method of Periplaneta americana protein and study its effect on wound healing of mice. [Method] The protein was seperated and extracted from P. americana by alkali extraction， salt extraction and enzyme extraction， protein content extracted by different methods were determined， the extraction techniques were optimized； effects of protein from P. americana on wound healing of mice were studied. [Result] The protein yield was highest under three conditions： alkali concentration 1.5%， extraction temperature 80 ℃， extraction time 1.0 h； salt concentration 1.0%， extraction temperature 40 ℃， extraction time 2.0 h； proportion of enzyme 0.6%， enzymolysis temperature 45 ℃， enzymolysis time 2.0 h. Protein from P. americana could promote mice wound healing， and healing time was shortened by nearly half. [Conclusion] Alkali liquor concentration， salt concentration and enzyme concentration have greatest impact on protein extraction. The order of extraction effect is enzyme extraction， alkali extraction， salt extraction， namely the optimal method for extracting protein from P. americana is trypsin extraction. Protein from P. americana can promote mice wound healing.

Key words Periplaneta americana；Protein；Extraction process；Wound healing

美洲大蠊（Periplaneta americana）是昆蟲纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”等。美洲大蠊最早的药用价值出现于《神农本草经》，用于治血痰症、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子[1]。在20世纪70年代，国内以美洲大蠊为材料就已经研制出了“康复新液”，主要治疗军队的枪伤，现在已经普及[2]。目前，国内对美洲大蠊的研究主要集中在各种蜚蠊的种群调查、分布、生长规律及侵害程度方面，防治及蜚蠊抗性方面，生长繁殖及各种杀灭剂对其的杀灭效率比较与杀灭机理的研究，其基因表达及致敏作用方面的研究，药用价值开发的研究等[3-4]。国外主要进行美洲大蠊形态结构以及病虫害防治的研究，医学方面主要进行消化道和神经冲动的研究，而有关美洲大蠊体内提取蛋白质方面的研究较少。

昆虫蛋白是当代一种具有巨大发展前景的蛋白质资源库，而且昆虫资源丰富，昆虫蛋白质含量高，营养价值也非常高，适合人类去开发利用。昆虫蛋白可以在食品、医药等各个方面发挥出巨大的作用[5-13]，昆虫蛋白系列食品已开始大规模工厂化生产[14-15]。笔者以美洲大蠊为试验原料，采用碱提法、盐提法和酶提法对美洲大蠊蛋白质进行分离和提取，测定不同方法提取美洲大蠊蛋白质的含量，优化美洲大蠊蛋白质的提取工艺；并用提取的蛋白质进行小鼠伤口愈合试验，研究美洲大蠊蛋白质对小鼠伤口愈合的影响，以期为推动医疗和保健事业提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。美洲大蠊购于河北安国药材大市场，经佳木斯大学罗志文副教授鉴定为蜚蠊科美洲大蠊（Periplaneta americana），药材标本现保存于佳木斯大学生物标本馆。

1.1.2

仪器。中药粉碎机、40目分样筛、电子天平、旋转蒸发仪、水浴锅、循环水多用真空泵、低速离心机、酸度计、恒温培养箱、分光光度计、冰箱、抽滤瓶、烧杯、移液管、洗耳球、胶头滴管、容量瓶、透析袋。

1.1.3

试剂。蒸馏水、石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、胰蛋白酶、盐酸。

1.2 方法

1.2.1

试验材料预处理。美洲大蠊经50 ℃烘干后，用粉碎机粉碎，过40目筛，保存备用。采用原料/石油醚=1/3（W/V）处理，除去脂溶性杂质，室温浸泡12～24 h，经过浓缩后回收石油醚。重复3次，采用60 ℃烘干后备用。

1.2.2 美洲大蠊蛋白质的提取工艺优化。

1.2.2.1 碱提取法。

（1）试验设计。选取碱液浓度（A）、提取温度（B）和提取时间（C）作为因素，每个因素3种梯度处理。采用L27（33）设计正交试验（表1），3次重复取平均值。测定某因素时，其他因素作非测定因素。

（2）提取方法。精确称取20 g美洲大蠊干粉样本，加入100 mL NaOH溶液，用玻璃棒搅拌均匀。经过一定的提取时间、一定的提取温度，再经过4 000 r/min离心去除虫渣。用10% HCl调节pH至4.5左右，可见明显的沉淀析出，再经过4 000 r/min离心4 min后得到粗盐蛋白。最后将盐蛋白装入透析袋内透析24 h得到去盐蛋白。去盐蛋白再烘干至恒重。

1.2.2.2 盐提取法。

（1）试验设计。选取盐液浓度（A）、提取温度（B）和提取时间（C）作为因素，每个因素3种梯度处理。采用L27（33）设计正交试验（表2），3次重复取平均值。测定某因素时，其他因素作非测定因素。

（2）提取方法。精确称取20 g美洲大蠊干粉样本，加入100 mL NaCl溶液，用玻璃棒搅拌均匀。经过一定的提取时间、一定的提取温度，再经过4 000 r/min离心去除虫渣。用10% HCl调节pH至4.5左右，可见明显的沉淀析出，再经过4 000 r/min离心4 min后得到粗盐蛋白。最后将盐蛋白装入透析袋内透析24 h得到去盐蛋白，去盐蛋白再烘干至恒重。

1.2.2.3 胰蛋白酶提取法。

（1）试验设计。选取酶占样本比例（A）、酶解温度（B）和酶解时间（C）作为因素，每个因素3种梯度处理。采用L27（33）设计正交试验（表3），3次重复取平均值。测定某因素时，其他因素作非测定因素。

（2）提取方法。精确称取20 g美洲大蠊干粉样本，加入适量胰蛋白酶和100 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀。经过一定的提取时间、一定的提取温度。然后将温度升至80 ℃杀灭胰蛋白酶，冷却后将虫渣过滤，烘干后得到酶提法的粗蛋白。最后将粗蛋白装入透析袋内透析24 h后烘干至恒重。

1.2.3 小鼠伤口愈合试验。

1.2.3.1

试验材料。美洲大蠊提取的蛋白质（4 ℃冰箱保存），雌雄小鼠各10只，鼠笼，解剖器材，酒精棉，消毒纱布。

1.2.3.2

试验方法。取雌雄各10只小鼠，隨机分成2组，每组10只，第1组为试验组，编号A1～A10，第2组为对照组，编号B1～B10。分别将每只小鼠背部的毛去掉，然后在每只小鼠背部相同位进行受伤处理，伤口均为1 cm2。将试验组受伤小鼠的伤口用酒精棉消毒，然后用美洲大蠊提取的蛋白质涂抹在伤口处，每天更换1次药物；对照组受伤小鼠的伤口消毒后不进行任何药物处理。用消毒纱布将2组小鼠的伤口包扎好，生长环境相同，喂食量相同。每天记录1次伤口愈合情况并进行对比。

2 结果与分析

2.1 美洲大蠊蛋白质的提取工艺优化

2.1.1 碱提取法。从表4可以看出，碱液浓度、提取温度和提取时间对美洲大蠊蛋白质的提取率均有影响。在测定碱液浓度（其他因素不变）时，碱液浓度在1.5%时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定提取温度（其他因素不变）时，提取温度为80 ℃时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定提取时间（其他因素不变）时，提取时间为1.0 h时美洲大蠊蛋白质提取率最大。方差分析表明，碱液浓度对美洲大镰蛋白质提取率的影响最大，其次是提取时间，提取温度的影响最小，即不同试验因素对美洲大蠊蛋白质提取率影响的顺序从大到小依次为A、C、B。综上所述，确定碱提取法对美洲大蠊蛋白质提取的最佳工艺方案为A3B3C2，即碱浓度为1.5%、提取温度为80 ℃、提取时间为1.0 h。

2.1.2 盐提取法。从表5可以看出，盐液浓度、提取温度和提取时间对美洲大蠊蛋白质的提取率均有影响。在测定盐液浓度（其他因素不变）时，盐液浓度在1.0%时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定提取温度（其他因素不变）时，提取温度为40 ℃时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定提取时间（其他因素不变）时，提取时间为2.0 h时美洲大蠊蛋白质提取率最大。方差分析表明，盐液浓度对美洲大蠊蛋白质提取率的影响最大，其次是提取温度，提取时间的影响最小，即不同试验因素对美洲大蠊蛋白质提取率影响的顺序从大到小依次为A、B、C。综上所述，确定盐提取法对美洲大蠊蛋白质提取的最佳工艺方案为A2B1C2，即盐浓度为1.0%、提取温度为40 ℃、提取时间为2.0 h。

2.1.3 胰蛋白酶提取法。从表6可以看出，酶占样本比、酶解温度和酶解时间对美洲大蠊蛋白质的提取率均有影响。在测定酶占样本比例（其他因素不变）时，酶占样本比例在0.6%时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定酶解温度（其他因素不变）时，酶解温度为45 ℃时美洲大蠊蛋白质提取率最大；在测定酶解时间（其他因素不变）时，酶解时间为2.0 h时美洲大蠊蛋白质提取率最大。方差分析表明，酶占样本比例对美洲大蠊蛋白质提取率的影响最大，其次是酶解温度，酶解时间的影响最小，即不同试验因素对美洲大蠊蛋白质提取率影响的顺序从大到小依次为A、B、C。综上所述，确定胰蛋白酶提取法对美洲大蠊蛋白质提取的最佳工艺方案为A3B2C1，即酶占样本比例为0.6%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2.0 h。

2.2 小鼠伤口愈合试验

从试验组小鼠和对照组小鼠伤口愈合过程中伤口直径大小（表7～8）可以看出，试验组小鼠，即由美洲大蠊提取的蛋白质进行换药试验的小鼠伤口愈合得更快；小鼠在受伤后第7天伤口已经开始愈合，在第10天基本全部愈合。而对照组小鼠在受伤后的第13天伤口开始愈合，在第17天才全部愈合。对照组小鼠伤口愈合时间基本是试验组小鼠系伤口愈合时间的2倍。综上所述，美洲大蠊提取的蛋白质可以促进伤口愈合，可以比伤口在正常情况下愈合缩短近一半的时间。

3 结论

采用不同的提取方法进行美洲大蠊的蛋白质提取纯化试验，并且使用提取的美洲大蠊蛋白进行小鼠伤口愈合试验，以获得具有生物活性的昆虫蛋白。结果表明，在碱浓度为1.5%、提取温度为80 ℃、提取时间为1.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高；在盐浓度为1.0%、提取温度为40 ℃、提取时间为2.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高；在酶占样本比例为0.6%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2.0 h时，美洲大蠊蛋白质提取率最高。而且用胰蛋白酶提取法提取美洲大蠊蛋白质的提取率均在35.00%以上，最高可达58.87%，所以3种方法提取美洲大蠊蛋白质的效果从大到小依次为酶提法、碱提法、盐提法，即美洲大蠊蛋白质提取的最优方法为胰蛋白酶提取法，并且在酶占样本比例为0.6%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2.0 h时最高提取率为58.87%。由试验组（即用美洲大蠊蛋白质进行换药试验）的小鼠与对照组小鼠伤口愈合情况可以看出，美洲大蠊提取的蛋白质可以促进伤口愈合，且愈合时间比正常情况下缩短近一半。该研究为进一步从昆虫中开发高效的昆虫蛋白类药物、食品和保健品等提供基础，对昆虫蛋白的开发利用起到良好的推广作用。

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