辣椒疫病罹病植株根际土壤细菌群落多样性分析

周涛 罗路云 陈红松 张卓 罗源华

摘要：【目的】分析辣椒疫病罹病植株根際土壤细菌群落多样性，为辣椒疫病防控提供理论依据。【方法】采集湖南长沙、吉首及永州地区辣椒疫病罹病植株根际土壤，运用IlluminaMiSeq高通量测序技术对土壤样品基因组DNA的16S rDNA-V4区进行测序分析，明确不同地区罹病辣椒植株根际土壤细菌群落多样性。【结果】3个地区罹病辣椒根际土壤的细菌OTU数量存在差异，独有OTU占总体比例各有差异，其中永州地区占其总数的30.18%、吉首地区占其总数的41.83%、长沙地区占其总数的24.07%，3个地区共有OTU占所有检测到OTU的14.95%。α多样性指标均表现为长沙地区最低，吉首地区最高。在门水平上，3个地区的罹病辣椒根际土壤微生物组成相似，优势菌门为Acidobacteria（酸杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）和Chloroflexi（绿弯菌门），但3个地区在相对丰度上表现一定差异。【结论】湖南永州、吉首和长沙地区辣椒疫病罹病植株根际土壤细菌多样性存在差异，以吉首最高、长沙最低；3个地区的罹病辣椒根际土壤微生物组成相似，但相对丰度存在差异。

关键词： 辣椒疫病；根际土壤；微生物群落；多样性

中图分类号： S436.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1014-05

Comparison on bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight

Abstract：【Objective】In the present study， bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight was studied to provide reference for control of pepper phytophthora blight. 【Method】Rhizosphere soil of peppers dying from phytophthora blight was collected from Changsha， Jishou and Yongzhou in Hunan. 16S rDNA-V4 regions of sample genome DNA were sequenced by IlluminaMiSeq high-throughput sequencing to analyze bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight in different areas. 【Result】Bacteria OTU number and proportions of unique OTU of rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of three areas were different. The proportion of Yongzhou accounted for 30.18% of the total， and that of Jishou accounted for 41.83% of the total and that of Changsha accounted for 24.07% of the total. Shared OTU of the three areas accounted for 14.95% of all detected OTU. Alpha diversity index were the lowest in Changsha and the highest in Jishou. At phylum level， the microbial composition was similar in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of three areas， the dominant bacteria were Acidobacteria， Proteobacteria， Actinobacteria and Chloroflexi， but relative abundance showed some differences. 【Conclusion】There is difference in bac-

terial community diversity in rhizosphere soil of peppers dying from phytophthora blight in Yongzhou， Jishou and Changsha， the diversity of Jishou is the highest while that of Changsha is the lowest. The microbial composition is similar in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of the three areas， but the relative abundance is different.

Key words： pepper phytophthora blight； rhizosphere soil； microorganism community； diversity

0 引言

【研究意义】辣椒（Capsicum annuum L.）是一种重要的经济作物，在我国常年种植面积超过130万ha。辣椒疫病（Pepper phytophthora blight）是由辣椒疫霉菌引起的一种真菌病害，可造成辣椒严重减产甚至绝收。辣椒疫霉菌侵染辣椒后可引起其器官腐烂或整株死亡（Sanogo and Ji，2013；Cao et al.，2014；Wang et al.，2014）；辣椒疫霉菌还可危害番茄、黄瓜、南瓜、茄子等多种茄科和葫芦科作物，严重制约作物生产（Polo-López et al.，2013；伍善东等，2015）。近年來，随着辣椒产业及辣椒种植区域的不断扩大，辣椒疫病危害面积也逐年扩大，造成严重的经济损失。土壤生态是农业生态系统的基础，与农业生态系统的可持续发展直接相关（Maul et al.，2014）。因此，研究辣椒疫病罹病植株根际土壤微生物的组成和多样性有助于进一步了解辣椒疫病的发生机制，对辣椒疫病的防治具有重要意义。【前人研究进展】土壤微生物、理化性质和酶是土壤生态系统的重要组分，是调节土壤微生态环境及功能的关键因子。土壤微生物能将土壤中的有机物和一些难分解的物质转化为植物生长所需的营养成分（Yin et al.，2014）。每克土壤中一般含有104～106个真菌个体、106～1010个细菌个体和10～103个原生生物，而植物根际土壤微生物的数量较一般土壤多。植物根际土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的部分，参与土壤中各种生物学和生物化学过程，对植物的生长发育和环境适应性产生重要影响。大量的土壤微生物聚集在植物根系周围，与植物根系相互作用，形成微生态环境（Nadeem et al.，2014）。涂璇等（2007）对接种生防放线菌后土壤和辣椒根系微生物区系的变化进行研究，发现拮抗放线菌可通过影响辣椒根际微生物来控制辣椒疫霉的生长繁殖。Nadeem等（2014）研究表明，在辣椒植株根际接种外来菌，可以调节植株根区的微生物群落结构，有利于保持和促进土壤肥力和健康状况，改变土壤理化性质和土壤酶活性，有可能从根本上控制辣椒疫病。Wang等（2014）发现芸苔属植物残体作为土壤熏蒸材料与有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌结合，可通过影响辣椒根际土壤中微生物群落多样性而达到防治辣椒疫病的目的。王秋君等（2015）进行了铜绿假单胞菌结合生物熏蒸防控辣椒疫病的效果研究，结果表明，生物熏蒸结合施用铜绿假单胞菌是一种环保的防控辣椒疫病方法。罗路云等（2017）研究表明，施用沼泽红假单胞菌PSB06可改善土壤微生物结构，提高土壤微生物群落丰富性及土壤中放线菌所占的丰度，达到防治辣椒疫病的目的。【本研究切入点】目前，微生物多样性的分析手段主要是基于传统的可培养方法，但该方法仅针对群落中的可培养微生物。运用高通量测序技术可准确、全面地对样品中细菌群落进行鉴定，但相关研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采集湖南长沙、吉首和永州地区辣椒疫病罹病植株根际土壤样品，运用IlluminaMiSeq高通量测序技术分析根际土壤中细菌群落多样性，以期为辣椒疫病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 样品采集

土壤样品分别采集于湖南长沙（CS）、吉首（JS）和永州（YZ）3个地区，每个地区随机选取5个辣椒疫病严重发生田块，使用五点取样法采集土样，采集后将土样混匀，分别装入采样袋，低温保藏，运输至实验室后置于-80 ℃保存。3个采样地均为常年种植同种辣椒品种，施肥条件一致，自然条件及土壤性质相似。

1. 2 DNA测序、扩增及测序

土壤DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒（MP Biomedicals，美国），具体步骤参照试剂盒使用说明。取5.0 μL基因组DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，浓度和纯度采用NanoDrop2000（Thermo Scientific，美国）测定，A260/A280在1.8～2.0，-20 ℃冰箱保存。以土壤DNA为模板，采用细菌16S rRNA基因V4区的引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系50.0 μL：5.0 μL 10×PCR Buffer（含20 mmol/L MgCl2），1.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 U Taq DNA聚合酶，1.0 μL DNA模板，ddH2O补至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s，68 ℃ 45 s，进行35个循环；最后68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增完成后产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR回收产物送诺禾致源生物信息科技有限公司进行IlluminaMiSeq高通量测序。

1. 3 数据处理

先使用Barcode（标签序列）将不同样品原始数据区分开，去除引物，删除低质量序列，然后使用FLASH程序（version 1.0.0）进行拼接，采用UCHIME（version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。计算DNA矩阵，使用UPARSE程序在97%的序列相似度水平下对序列划分操作分类单元（OTU）。RDP-Classifer分析设置置信度参数50%。对处理数据进行均一化处理，计算不同分类水平上的OTU数量和Chao1，绘制稀释曲线。通过Chao1、香农指数（Shannon）和辛普森指数（Simpson）多样性评估序列文库的α多样性。以上分析均在Galaxy网站平台上（http：//zhoulab5.rccc.ou.edu：8080/root）及R语言vegan程序包完成。

2 结果与分析

2. 1 3个地区辣椒根际土壤微生物群落OTU差异及多样性比较

由图1可看出，3个地区土壤样品间细菌群落多样性存在差异，各样品的稀释曲线趋于平缓，即认为测序深度已基本覆盖样品中所有的物种，测序数据量足以反映样品中的物种多样性，且测序达饱和时表现为α多样性JS>YZ>CS。对长沙、吉首和永州3个地区辣椒根际土壤样品细菌群落的α多样性指标进行评估，其中Shanon指数变化范围为5.59～6.45，Simpson指数变化范围为71.08～245.42，Chao1变化范围为1016.14～ 1875.06（表1），3组数据均表现为长沙地区最低，吉首地区最高。原始数据经质控后按97%的序列相似性可划分为2662个OTUs，其中永州地区检测到1524个OTUs、吉首地区检测到1841个OTUs、长沙地区检测到910个OTUs；3个地区独有OTU所占比例各有差异，其中永州地区占其总数的30.18%、吉首地区占其总数的41.83%、长沙地区占其总数的24.07%，3个地区重合OTU占所有检测到OTU的14.95%，说明土壤样品虽然均来源于辣椒疫病死亡植株根际，但3个地区在OTU水平上存在明显差异（图2）。

2. 2 细菌群落结构比较

测得的细菌群落所有序列可被注释到27个门、60个纲、75个目和147个科（表2）。从图3可看出，在门的水平下，永州地区占优势地位的门有Acidobacteria（酸杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）和Chloroflexi（绿弯菌门）；吉首地区占优势地位的门有Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Planctomycetes（浮霉菌门）；长沙地区占优势地位的门有Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Firmicutes（厚壁菌门）和Thaumarchaeota（奇古菌门）。永州、吉首和长沙地区在门水平上微生物组成相似，但在相对丰度上表现出一定的差异，其中Actinobacteria的相对丰度分别为9.71%、25.07%和13.28%，Proteobacteria为30.38%、17.47%和17.31%，Chloroflexi为5.62%、9.12%和12.67%，Acidobacteria为22.18%、13.82%和2.96%。这4种优势菌门在3个地区的相对丰度总和分别为67.89%、65.48%和46.22%。在不同分类水平下相对丰度分析结果表明，Proteobacteria是最优势门，Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）为最优势纲，Actinomycetales（放线菌目）为优势目。

3 讨论

前人主要通过分离培养对土壤微生物多样性进行研究，随着分子生物学技术的不断发展，发现传统的方法已不能全面鉴定土壤样品中的微生物，只能鉴定其中可培养部分。马云艳等（2015）对辣椒疫病病株和健株根际土壤中的可培养微生物进行鉴定并对其群落多样性进行检测，但由于技术的局限性未能对其中不可培养微生物进行多样性分析。植物根际与其他生境一样，根际微生物不仅具有丰富的多样性，还含有大量未培养的微生物种群（Prosser，2002），因此有必要采用非培养手段对根际微生物进行研究。本研究运用高通量测序技术分析辣椒疫病罹病植株根际土壤细菌群落多样性，有助于全面了解湖南长沙、吉首和永州地区辣椒疫病根际土壤中细菌多样性情况，为采用微生态调控技术防治辣椒疫病提供理论基础。

根据Fierer和Jackson（2006）的研究结果可知，Acidobacteria、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacter-

oidetes在所有的生物群中均占优势地位，且在细菌群落组成上差异不显著。近年来，越来越多的研究表明在各种不同土壤生态系统中细菌群落的优势门组成具有相似性（Fierer et al.，2011；Wang et al.，2011；Shen et al.，2013）。本研究中，在门水平上Acidobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria在3个地区均占优势地位，与前人的研究结果一致，但在相对丰度上3个地区的优势门存在一定差异。

通常来说，健康植株根际土壤上比发病植株根际土壤拥有更多独有的OTU，同时病株根际土壤细菌群落中更低的多样性表明发病程度越高（Rosenzweig et al.，2012）。本研究比较了湖南永州、吉首和长沙3个地区辣椒疫病罹病植株根际土壤样品的OTU差异，结果显示3个地区独有的OTU所占总体比例存在差異，其中永州地区占其总数的30.18%、吉首地区占其总数的41.83%、长沙地区占其总数的24.07%，表现为吉首>永州>长沙；同时，3个地区稀释曲线及α多样性结果也表现为吉首>永州>长沙，与OTU的结果一致。

4 结论

湖南永州、吉首和长沙3个地区辣椒疫病罹病植株根际土壤细菌群落多样性分析结果表明，3个地区的辣椒疫病致死发病程度不同，吉首地区的辣椒疫病发病程度最重，长沙地区较低；3个地区的辣椒疫病罹病植株根际土壤微生物组成相似，优势菌门均为Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi，但在相对丰度上存在一定差异。

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（責任编辑 麻小燕）