家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP25转录分析及其免疫响应

张永红 朱峰 唐芬芬 邵榆岚 白兴荣

摘要：【目的】分析家蠶丝氨酸蛋白酶（SP）基因序列BmSP25及转录情况，明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒（BmNPV）入侵的免疫应答机制，为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据。【方法】克隆BmSP25基因序列，对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析；利用GeneDoc和MEGA 5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析，采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析，并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平。【结果】BmSP25基因的ORF全长885 bp，编码294个氨基酸，其中第1～17位氨基酸为信号肽，去信号肽的分子量为29.1 kD，理论等电点为7.8。BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成；其氨基酸序列同源性比对分析发现，BmSP25（BGIBMGA008514-PA）与蓓带夜蛾SP序列（GenBank登录号ADM35105）的同源性最高，为62.1%。BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达，且在整个幼虫时期呈持续性表达。BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化，至感染6 h时呈下调趋势，而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达。【结论】BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用。鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点，因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫。

关键词： 家蚕；丝氨酸蛋白酶（SP）基因；表达；BmNPV感染；转录分析

中图分类号： S884.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1093-06

Abstract：【Objective】Sequence and transcription state of serine protease（SP） gene BmSP25 were analyzed， the immune response mechanism of its expression pattern against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV） were defined， in order to provide theoretical basis for exploring the function of BmSPs in immune responses of B. mori. 【Method】The sequence of BmSP25 gene was cloned， bioinformatics was used to analyze the amino acid sequence， molecular weight， functional domain of the coding region of this gene. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of BmSP25 amino acid sequence were conducted by GeneDoc and MEGA5.0 software. BmSP25 gene transcription in different tissues and at different development stages were analyzed by semi-quantitative PCR， and transcription level of BmSP25 mRNA in intestinal tissue inoculated by BmNPV were detected by real-time quantitative fluorescence PCR. 【Result】The full length of BmSP25 open reading frame（ORF） was 885 bp， encoding 294 amino acids， and from the 1st to the 17th ones were signal peptides. The molecular mass without signal peptides were 29.1 kDa and theoretical isoelectric point was 7.8. BmSP25 protein was composed of 4 α-helices， 15 β-folds and some irregular coils. Homology alignment of amino acid showed that BmSP25（BGIBMGA008514-PA） shared the highest homology（62.1%） with SP sequence of Mamestra configurata（GenBank accession number： ADM35105）. BmSP25 gene was specifically expressed in midgut tissues and continuously expressed at the whole larval stage of B. mori. The transcription level of BmSP25 gene was changed after BmNPV inoculation， BmSP25 mRNA was down-regulated at 6 h， but it was up-regulated obviously at 3， 12 and 24 h of inoculation. 【Conclusion】 BmSP25 plays an important role in the process of immune response from intrusion of BmNPV in B. mori. Since insect SP contains highly conserved specificity sites of substrate， substrate analogues and gene site-directed mutation can be utilized to control agricultural and forestry pests.

Key words： Bombyx mori； serine protease（SP） gene； expression； BmNPV inoculation； transcription analysis

0 引言

【研究意义】丝氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，在昆虫体内消化、生长发育、免疫应答等方面发挥着重要作用（Rawlings and Barrett，1993；Krem and Di Cera，2002；Zou et al.，2006）。家蚕SP基因家族包括BmSPs及其同源体BmSPHs（Xia et al.，2004），是家蚕先天性免疫中免疫通路级联的关键酶类（Hedstrom，2002），因此研究BmSPs基因家族成员对揭示其参与家蚕免疫应答功能具有重要意义。【前人研究进展】昆虫体液免疫中的SP参与酚氧化酶原激活级联，能激活以无活性前体形式存在的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，proPO）形成有活性的酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），进而催化家蚕合成醌类物质及黑色素以防御病原微生物入侵（Cerenius et al.，2008）。BmSPs含有修剪结构域clip，该结构域含有高度保守TAAHC、DIAL和GDSGGP的活性位点（Perona and Craik，1995），剪切羧基端的一些特殊氨基酸即可活化proPO（Zou et al.，2006；陈建平等，2012）。Xia等（2007）研究发现，BmSPs基因家族中以BmSP82基因在正常家蚕体内的转录水平最高，当家蚕感染核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）后该基因呈下调表达；Tanaka等（2008）鉴定了参与家蚕免疫应答的BmSPs和BmSPHs基因，并证实其某些成员基因在中肠特异表达，在正常家蚕体内主要参与食物消化。Zhao等（2010）利用家蚕基因组数据库并依据其他物种的SPs基因序列共鉴定出143个基因，分别标记为BmSP1～ BmSP143，其中包括51个BmSPs和94个BmSPHs。BmSPs基因功能广泛，因其在家蚕体内不同组织和发育时期的表达差异，进而发挥着不同的功能（Srinivasan et al.，2006）。BmSPs基因家族中某些成员在家蚕中肠特异表达，如BmSP2基因在防御BmNPV方面发挥着重要作用（Nakazawa et al.，2004）、BmSP36和BmSP141基因参与家蚕食物消化过程（刘华伟等，2016；Liu et al.，2016）。【本研究切入点】BmSPs除了在食物消化方面发挥作用外，还参与防御BmNPV侵染的免疫应答过程，但至今鲜见有关BmSPs基因免疫功能机理研究的报道。【拟解决的关键问题】研究分析BmSP25基因序列及其转录情况，并结合BmNPV侵染明确其表达规律对防御BmNPV的免疫应答机制，为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

家蚕品种大造和BmNPV均由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所保存提供。家蚕喂食桑叶，按当地的常规管理模式进行科学饲养；BmNPV使用浓度5.27×106 PIB/mL。主要试验试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、M-MLV反转录试剂盒、PCR相关试剂、实时荧光定量SYBR Primix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，凝胶回收试劑盒及其他化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 家蚕样品采集 家蚕饲养至五龄第3 d时收集其幼虫头、血液、表皮、中肠、脂肪体、马氏管、气管、丝腺、精巢和卵巢等组织样品；家蚕饲养过程中，收集蚁蚕到上蔟不同发育时期的家蚕个体；在BmNPV处理试验中，家蚕按常规方法饲养至五龄起蚕后随机分成两组，其中，试验组每头家蚕添食10.0 μL病毒悬浮液（5.27×106 PIB/mL），对照组添食等量ddH2O。分别采集添食后3、6、12和24 h的家蚕中肠组织，3次重复，每个重复至少取5头家蚕，采集样品置于-80 ℃保存备用。

1. 2. 2 家蚕总RNA提取及cDNA合成 将收集的家蚕组织样品经液氮研磨，参照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit总RNA提取试剂盒说明提取RNA。以紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度，保留OD260/OD280在1.80～2.00的样品，根据M-MLV反转录酶使用说明将抽提的RNA反转录合成cDNA。

1. 2. 3 BmSP25基因序列分析 参照家蚕基因组数据库（http：//silkworm.genomics.org.cn/）设计BmSP25基因的扩增引物（表1）。以家蚕中肠组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经胶回收试剂盒回收，纯化后连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5α，以M13/M13R引物对扩增验证阳性克隆，阳性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用在线分析软件对BmSP25基因编码蛋白的分子量、等电点（http：//web.

expasy.org/compute_pi/）、信号肽（http：//www.cbs.dtu.dk/

services/SignalP/）、功能结构域（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、蛋白质二级结构（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/）和三级结构（https：//swissmodel.expasy.org/）进行预测；利用GeneDoc对BmSP25与其他物种的SP进行多序列比对分析，以MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树（Bootstrap 1000次重复检验其可靠性）。

1. 2. 4 BmSP25时空转录情况分析 以Bmactin3为内参基因，设计BmSP25基因半定量RT-PCR扩增引物（表1），以蚁蚕至五龄第7 d幼虫各组织器官cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行31个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 5 BmNPV感染家蚕后BmSP25基因转录分析

设计BmSP25基因实时荧光定量PCR扩增引物（表1）。以不同时段的两组家蚕中肠组织cDNA为模板、Bmactin3为内参基因进行实时荧光定量PCR检测，参照SYBR Primix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明配制反应体系（20.0 μL），即SYBR预混液10.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，模板1.0 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。每个样品3次重复，收集试验组和对照组目的基因与内参基因的Ct进行统计分析，并采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 结果与分析

2. 1 BmSP25基因克隆与序列分析结果

根据家蚕基因组数据库设计扩增BmSP25基因的特异性引物，以家蚕五龄第3 d的中肠组织cDNA为模板进行PCR扩增，目的基因片段测序结果显示，BmSP25基因的ORF全长885 bp，编码294个氨基酸。其中，第1～17位氨基酸为信号肽，为分泌型蛋白。经NCBI Conserved Domain Search在线分析发现，第54～288位氨基酸为类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶结构域（Trysin-like serine protease domain），去除信号肽后，其分子量为29.1 kD，理论等电点为7.8。利用PSIPRED Server在线预测BmSP25蛋白质的二级结构，结果表明，BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成（图1）；通过SWISS-MODEL同源建模预测其三级结构，发现BmSP25蛋白的三级结构（图2）与其二级结构特征一致，蛋白结构以β折和无规则卷曲为主。

BmSP25氨基酸序列（BGIBMGA008514-PA）与 NCBI上登录的其他昆虫SP进行多序列比对分析，结果显示，各序列中均含有SP高度保守的3个催化活性位点（His57、Asp102和Ser195），与活性相关的AAHC和GDSGGPL及形成二硫键的3对半胱氨酸残基也较保守（图3）。其中，BmSP25与蓓带夜蛾SP序列（GenBank登录号ADM35105）的同源性最高，为62.1%。采用MEGA 5.0的邻接法（Neighbor-joining）构建基于SP序列的系统发育进化树（图4），结果显示，鳞翅目昆虫蛋白酶聚为两支（Clade I和Clade II），其中BmSP25与蓓带夜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟和小蔗螟的SP序列在亲缘关系上较近。

2. 2 BmSP25基因时空转录分析结果

通过半定量RT-PCR检测BmSP25基因在五龄第3 d家蚕各组织中的表达情况，结果显示，BmSP25基因在中肠组织中特异表达（图5-A）。对家蚕蚁蚕至五龄第7 d整个幼虫时期进行表达谱分析，结果发现BmSP25基因在整个家蚕幼虫时期呈持续性表达（图5-B）。

2. 3 BmNPV感染家蚕后BmSP25基因的转录分析结果

以添食ddH2O的五龄起蚕为对照组、BmNPV感染的五龄起蚕为试验组，利用实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在家蚕中肠组织中的转录水平，结果（图6）显示，与对照组相比，试验组家蚕感染BmNPV 3 h后BmSP25基因轉录水平开始升高，至感染6 h时表现为下调表达，但感染12和24 h时检测发现又呈明显上调表达。说明BmSP25基因表达受病原微生物BmNPV入侵的影响。BmNPV侵染家蚕的第一道屏障是中肠，结合BmSP25基因在中肠组织中的特异表达，认为其在防御BmNPV侵染方面发挥重要作用。

3 讨论

SP在昆虫体内主要参与消化、发育和免疫应答等生理过程。本研究成功克隆获得BmSP52基因（BGIBMGA008514-TA），其基因序列由5个外显子和4个内含子组成，编码区全长885 bp，编码294个氨基酸，其中第1～17位氨基酸为信号肽，去信号肽的分子量为29.1 kD，理论等电点为7.8。氨基酸多序列比对分析结果表明，BmSP52与蓓带夜蛾的SP序列同源性最高（62.1%）；而系统发育进化树显示，家蚕与夜蛾科昆虫（蓓带夜蛾与草地贪夜蛾）、螟蛾科（玉米螟与小蔗螟）蛋白酶同聚在Clade II分支上。胰蛋白酶类的SP底物特异性位点主要是189S/189G-216G-226G/226A（Perona and Craik，1995），BmSP25与螟蛾科（玉米螟与小蔗螟）在底物特异性位点189G处高度保守，与多序列比对分析结果和系统发育进化树分析结果一致。鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点，因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫。

BmSP52基因在家蚕中肠组织中特异表达，且在整个幼虫时期呈持续性表达。中肠是昆虫消化食物和吸收营养的主要器官，也是抵御BmNPV等病源微生物入侵的重要场所。中肠消化液含有多种抗BmNPV的相关蛋白，如家蚕脂肪酶（Bmlipase-1）（Ponnuvel et al.，2003）、BmSP2（Nakazawa et al.，2004）、家蚕还原型辅酶II氧化还原酶（NADPH-oxidoreductase-like）（Selot et al.，2007）、红色荧光蛋白（Red fluorescent protein）（Sunagar et al.，2011）和碱性胰蛋白酶Trypsin（Ponnuvel et al.，2012）。SP在昆虫免疫应答过程中主要参与信号调控，在病原微生物入侵时激活细胞信号转导路径，如激活昆虫免疫反应的核心细胞信号Imd和Toll通路（Hultmark，2003），进而诱导抗菌肽合成（Weber et al.，2003）。本研究结果表明，BmSP52基因转录水平在家蚕感染BmNPV后发生明显变化，在感染6 h时呈下调趋势，而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达，表明BmSP52基因表达受病原微生物BmNPV诱导而参与家蚕幼虫免疫应答过程。由于BmSP25与BmSP36、BmSP141具有高度保守胰蛋白酶的底物特异性基序，故推测BmSP25在家蚕中肠食物消化方面也发挥重要作用，但具体原理有待进一步验证。

4 結论

BmSP25在家蚕中肠组织中特异表达，且在整个幼虫期呈持续性表达，尤其在防御BmNPV入侵的免疫应答过程中发挥重要作用。鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点，因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫。

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（責任编辑 兰宗宝）