番茄泛素活化酶基因家族进化及表达模式分析

赵秋芳　马海洋　陈曙　陈宏良　贾利强

摘 要 泛素活化酶是蛋白泛素化所需的第一个酶，在泛素蛋白酶体途径中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从番茄基因组中鉴定出2个泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，UBA）基因，命名为SlUBA1和 SlUBA2。序列分析表明SlUBA1和SlUBA2基因的CDS序列长分别为3 060和3 255 bp，分别编码1 019和1 084个氨基酸，编码蛋白分子量为114.15和120.46 ku，分别位于第6和9染色体。2个基因均含有5个内含子，编码蛋白均为酸性、疏水性蛋白；对蛋白二级结构分析发现2个UBA蛋白均以α-螺旋和无规则卷曲为主；亚细胞定位预测均定位于细胞核。序列比对和进化树分析表明番茄UBA基因与其他物种UBA基因相似性高，进化过程非常保守。番茄不同组织表达分析结果表明2个UBA基因在根系和花的表达量较高，果实成熟过程中的表达量相对较低。非生物胁迫试验结果表明：SlUBA1基因在低温、干旱和盐胁迫下均上调表达；而SlUBA2基因对非生物胁迫没有明显响应，这些结果表明SlUBA1基因可能参与番茄对低温、干旱和盐胁迫的响应。

关键词 番茄；泛素活化酶基因；进化分析；基因表达

中图分类号 S641.2 文献标识码 A

Abstract Ubiquitin activating enzyme is the first enzyme which combined with ubiquitin and protein， playing an important role in the ubiquitin-proteasome pathway（UPP）. In this study， we identified two ubiquitin activating enzyme（UBA）genes designated as SlUBA1 and SlUBA2 from tomato genome using bioinformatics methods. Sequence analysis of SlUBA1 and SlUBA2 revealed that the CDS lengths waere 3 060 and 3 255 bp respectively， encoding the proteins of 1 019 and 1 084 amino acids with predicted molecular weight of 114.15 and 120.46 ku， located on No.6 and 9 chromosome， separately. The two SlUBA genes both contained 5 introns， encoding acidic and hydrophobic protein. The predicted secondary structure suggested that the main structure of two proteins were alpha helix and random coil； The subcellular localization were predicted in the nucleus. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the UBA genes of tomato had high similarity to the UBA genes in other species and indicated that the evolution process of the UBA family was very conservative. The expression of two SlUBA genes in different tissues were investigated， which were highly expressed in roots and flowers， while had low expression in fruit ripening stage. Abiotic stress treated results showed that the expression levels of SlUBA1 was upregulated under cold， drought and salt stress， while the gene of SlUBA2 had no significant change. These results indicated that SlUBA1 genes may be involved in the response of tomato to low temperature， drought and salt stresses.

Key words Tomato； ubiquitin activating enzyme（UBA）gene； phylogeny analysis； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.016

蛋白質作为非常重要的生命大分子，在生命活动的各个方面发挥着重要的作用。蛋白质的合成和降解均影响着生命活动的进行。泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway）是真核生物蛋白高效专一降解的重要调控机制之一。蛋白泛素化过程主要通过3种酶来完成：首先泛素活化酶（E1）在ATP的帮助下催化泛素分子C末端甘氨酸（Gly）残基与E1的半胱氨酸（Cys）残基形成一个高能硫酯键，活化的泛素分子通过转酯作用从E1转移到泛素结合酶（E2）的Cys残基上，形成E2-Ub复合物，E2-Ub复合物在 泛素连接酶（E3）协同作用下，把活化的泛素分子转移到靶蛋白上[1]。泛素活化酶（E1）是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，在蛋白泛素化过程中发挥着重要的作用。泛素活化酶（E1）的催化能力很强，在大部分物种中只需要一种E1酶就可以激活泛素化的整个过程[2]。

E1是一种广泛表达的多肽，大约1 100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。1991年首次发现人的泛素活化酶UBE1，并证实半胱氨酸残基与泛素活化酶的活性功能相关[3]。目前，泛素活化酶基因己经从多种生物中分离得到，包括兔、酵母、小鼠、拟南芥、小麦、烟草、茶树等[4-10]。酵母基因组编码单一的泛素活化酶，该基因缺失对酵母是致死的，说明E1蛋白对于酵母细胞的生存是至关重要的[11]。在哺乳动物中，泛素活化酶首次被定位在细胞核和细胞质中，并存在2种亚型E1a和E1b[12-15]。在植物中存在多种类型E1基因，在拟南芥中有2个基因编码泛素活化酶，分别为AtUBA1和AtUBA2，2个基因编码蛋白存在81%的相似氨基酸[7]。从小麦胚芽中分离到3种类型的 E1蛋白，编码基因命名为 TaUBA 1-3[8]，在烟草中分离出烟草泛素活化酶基因NtE1A和NtE1B[9]。研究表明植物与酵母和哺乳动物的E1的序列高度保守[16-17]。目前，有关泛素活化酶的研究主要集中在拟南芥、小麦等模式植物中，番茄泛素活化酶的研究仍未见报道。番茄是重要的蔬菜作物，同时也是研究果实成熟和植物逆境胁迫的模式植物。随着番茄全基因组的测序成功，更多基因资源可供挖掘利用，也为鉴定番茄E1家族基因提供数据支持。本研究中，从番茄全基因组数据库中鉴定出2个番茄泛素活化酶（E1）基因，并对其进行理化性质、基因结构、序列比对和进化等生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR技术对番茄泛素活化酶基因家族成員在不同组织和逆境胁迫下的表达模式进行分析，以期为后期番茄泛素活化酶的功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试番茄品种为测序品种“Heinz 1706”，在番茄营养生长阶段取根、茎、 叶，在生殖生长阶段取花和各果实发育阶段（包括小果、绿熟果、转色果、红熟果）样品。胁迫处理试验：选取“Heinz 1706”生长饱满的种子，培养2周后，选取生长一致幼苗各12株进行胁迫处理. 低温处理：将幼苗置于4 ℃培养箱培养；干旱处理：将幼苗置于20% PEG-6000溶液中；盐处理：将幼苗置于200 mmol/L NaCl 溶液中。样品分别在处理0、1、6、24 h取样，并用液氮速冻后放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 番茄泛素活化酶基因家族检索和鉴定 在拟南芥基因组数据库Tair（https：//www.arabidopsis.org/）中搜索出已知的泛素活化酶（UBA）基因及其编码的蛋白序列，根据拟南芥UBA的蛋白序列在番茄基因组数据库SOL（https：//solgenomics.net/）和Phytozome11.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）搜索番茄UBA候选基因，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对候选基因的氨基酸序列结构域进行鉴定，凡是含有UBA基因保守结构域的蛋白即为番茄UBA成员。在番茄基因组数据库SOL中查出了所有UBA基因的开放阅读框长度、染色体位置、内含子个数等基本信息；利用在线工具Expasy roteomics Server（http：//web.expasy.org）进行分子量和等电点分析；利用在线SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测候选蛋白的二级结构；利用plant-mploc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析番茄UBA基因成员的亚细胞定位，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线工具对基因外显子-内含子作图。

1.2.2 番茄泛素活化酶序列比对和进化树分析

利用Clustal X1.83对番茄、拟南芥、小麦的UBA家族氨基酸序列进行多重比对，并用MEGA 6.0构建番茄、拟南芥、小麦、小鼠、酵母、人类的UBA家族成员进化树，分析其进化关系。进化树采用遗传距离建树法的相邻连接法（Neighbor-Joining，NJ）建树，对生成的树进行自检，重复设定为1 000次。

1.2.3 番茄泛素活化酶基因表达分析 采用植物RNA提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司产品）提取番茄总RNA，样品RNA经检测质量和浓度后，利用M-MLV（Rnase H-）逆转录酶（TaKaRa公司）合成cDNA模板，稀释备用。根据番茄UBA基因序列，采用Primer Premier 5.0软件进行设计定量引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列详见表1。利用荧光实时定量 PCR试剂盒为SYBR Green Realtime PCR Master mix（TaKaRa公司），反应体系为10 μL，SYBR Premix Ex TaqTmⅡ，5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，无菌双蒸馏水2 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，3次重复，采用2-ΔΔCt的方法计算UBA基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 番茄UBA家族基因鉴定及理化性质分析

为鉴定番茄UBA家族基因，本研究采用拟南芥的氨基酸序列作为靶序列，利用BLASTP方法对番茄基因组数据库和Phytozome11.0进行检索，并对候选基因进行结构域检测，最终鉴定出2个番茄UBA基因，SGN编号为Solyc06g007320.2.1和Solyc09g018450.2.1，分别命名为SlUBA1和SlUBA2。番茄UBA基因家族的CDS长度、氨基酸数目、内含子个数、分子量以及等电点、不稳定指数、疏水性和脂肪系数等理化性质均非常相似（表2、图1）。

SlUBA1位于第6染色体，基因方向为反向，CDS序列长度3 060 bp，编码1 091个氨基酸，5个内含子，编码蛋白分子量为114.15 ku，等电点为5.05，不稳定指数为31.88，平均疏水性（GRAVY）-0.233， 脂肪系数（AI）86.15。SlUBA2位于第9染色体，基因方向为正向，CDS序列长度3 255 bp，编码1 084个氨基酸，5个内含子，编码蛋白分子量为120.46 ku，等电点为4.99，不稳定指数为34.33，平均疏水性（GRAVY）-0.232，脂肪系数（AI）85.48（表2）。

蛋白二级结构分析（表3）表明：2个UBA蛋白的二级结构均由α-螺旋，扩展链结构，β-转角，无规则卷曲4种形式组成，且以α-螺旋所占比例最高，其次为无规则卷曲，而β-转角所占比例最小。蛋白质亚细胞定位预测结果表明2个番茄UBA蛋白均定位于细胞核中。

2.2 番茄UBA家族基因序列比对和进化树分析

对不同物种中UBA蛋白序列进行完全比对发现SlUBA1和SlUBA2与拟南芥、小麦中UBA蛋白的同源性非常高，而且具有非常保守的序列和结构。序列比对发现SlUBA1与AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3蛋白序列一致性分别为78%、80.6%、78.8%、74.6%；SlUBA2与AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3的一致性分别为74%、74.5%、76.1%、72.3%。SlUBA1和SlUBA2之间的一致性达80.3%（表4）。

为了更好的了解E1基因家族成员与其他真核生物E1基因间的进化关系，利用已知的人类、小鼠、酵母、拟南芥、小麦和番茄的UBA蛋白共10个序列构建了系统进化树（图2）。系统发育进化树中SlUBA1和SlUBA2与拟南芥和小麦UBA聚在一起，验证UBA基因进化过程的保守性，且UBA基因的祖先在单双子叶植物分离之前就已存在。另外发育树植物、动物和酵母等真核生物中的UBA基因大都聚集在一起，这也说明UBA基因进化过程具有很高的保守性。

2.3 番茄UBA家族基因在番茄不同组织中的表达模式分析

为了更好了解SlUBA基因的潜在功能，分析了SlUBA基因在不同发育时期的时空表达模式，详见图3。SlUBA基因在番茄8种组织/器官中均有表达，但其表达模式有所差异。SlUBA1在根系中表达量最高，其次为花，在小果中表达量最低，表达量最高约为最低的3倍。SlUBA2在花中的表达量最高，其次为根，在绿熟果的表达量最低，表达量最高约为最低的4倍。

2.4 番茄UBA家族基因在非生物胁迫下的表达分析

图4所示为番茄UBA家族基因在低溫、干旱和盐胁迫下的表达量变化。4 ℃低温胁迫处理下，SlUBA1基因表达量在1～6 h下降，24 h达到最高值，为对照处理的2.95倍；在干旱胁迫下，SlUBA1表达量在1 h迅速增加到最大值，为对照的2.45倍，随后6～24 h表达水平逐渐下降；盐胁迫处理SlUBA1呈逐渐上升的趋势，24 h表达量最高，为对照的3.5倍。相对SlUBA1表达量的变化，SlUBA2在各胁迫处理下均未见显著的表达量变化。这些实验结果表明SlUBA1可能响应低温、干旱和盐胁迫，而SlUBA2对非生物胁迫没有明显响应。

3 讨论

泛素活化酶是泛素蛋白酶体介导的蛋白质降解系统中关键酶，目前已有多个真核生物中的泛素活化酶基因被鉴定出来，但是番茄中仍未见报道。本文通过生物信息学方法共鉴定2个SlUBA基因，其编码氨基酸分别为1 019和1 084 aa，预测蛋白分子量为114.15和120.46 ku，与已知的拟南芥、小麦和烟草的UBA蛋白相似[7-9]，且2个SlUBA基因的内含子数量和结构也与拟南芥相一致[7]。已有研究表明拟南芥中NtE1A，NtE1B二者氨基酸序列相似度达81%，烟草NtUBA1和NtUBA2氨基酸序列相似度达98%，本研究中序列比对结果表明SlUBA1和SlUBA2氨基酸序列相似度达80.3%，与拟南芥和烟草的研究结果相一致。另外番茄与拟南芥和小麦的UBA氨基酸序列相似度在74%～80%之间，表明UBA基因在物种进化过程非常保守，与其他真核生物的进化树分析结果这证实了UBA基因进化的保守性。

E1s可以激活泛素分子，是蛋白泛素化途径中第一个起作用的酶，因此E1基因的表达模式有可能对植物的组织建成和生长发育有一定的作用。拟南芥中UBA基因在不同组织中均有表达，且UBA在代谢较为活跃的组织细胞中表达量最高，包括维管束中的薄壁细胞、新叶、分生组织、花药、子房和柱头等[7]。番茄不同组织中UBA基因的表达模式分析结果表明：番茄UBA基因在不同组织中均有表达，但其表达量存在差异，2个基因均在根和花中表达量较高，而在果实发育各个发育阶段表达量相对较低，且在大多数组织中呈现共表达的模式，这与拟南芥中的研究结果一致[7]，该研究结果说明在番茄根系和花的生长发育需要泛素化途径，而在果实发育各个时期需求较小。

研究发现，高等植物在应对高温、低温、干旱等逆境时均会产生各种胁迫蛋白[18]，而泛素蛋白酶体途径（UPP）可以高效且高度选择性地对细胞内某些蛋白质进行部分或完全降解，实现对多种代谢过程的内在生理调节[19]，在逆境条件下，泛素蛋白酶体降解途径通过降解不正常的蛋白以维持植物体的氨基酸的数目；同时通过去除一些限速反应酶和一些调节因子来精确调控生理平衡，以使植物适应外界环境，抵御外界胁迫。烟草侵染烟草花叶病毒（TMV）和番茄花叶病毒（ToMV）后NtE1A和NtE1B基因上调表达，侵染黄瓜花叶病毒（CMV）并未上调表达，另外NtE1A和NtE1B基因在烟草受到机械伤害和水杨酸、茉莉酸、乙酸激素处理后均上调表达[9]。这一研究结果表明UBA作为泛素蛋白酶体降解途径中的一个关键酶，其在植物应答逆境胁迫发挥作用。最新研究结果表明拟南芥超表达盐土植物香雪球的LmVHA-E1基因可以显著提高其耐旱和耐盐能力[20]，这也证实E1基因响应胁迫环境中的作用。本研究分析了番茄UBA基因在低温，盐和干旱胁迫下的表达差异，结果表明在低温、盐和干旱胁迫下SlUBA1基因均上调表达，而SlUBA2对低温、、盐和干旱等逆境胁迫没有明显响应，表明SlUBA1基因表达受非生物胁迫诱导，可以推测在番茄的泛素蛋白酶体途径中主要是由SlUBA1基因主要负责泛素活化作用。而在烟草中2个E1基因在响应逆境胁迫和应答激素处理时呈现共表达模式[9]，与本研究结果不一致，说明不同作物的E1基因应答逆境胁迫的模式并不完全相同。

本文通过对番茄UBA基因家族进行全基因组鉴定，共鉴定出2个候选SlUBA成员，并对其理化性质、基因结构、序列比对和系统进化等进行了生物信息学分析，同时分析了SlUBA在番茄不同组织和非生物胁迫下的表达模式差异，结果表明SlUBA基因在根和花中表达量较高，在果实发育阶段表达量相对较低；SlUBA1基因能够被多种非生物胁迫（低温、干旱、盐）不同程度诱导表达，而SlUBA2基因表达未受非生物胁迫诱导，可以推测在蛋白泛素化过程中可能是SlUBA1起主要的泛素活化作用。

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