胡椒连作对土壤微生物群落功能多样性与群落结构的影响

王灿　李志刚　杨建峰　祖超　郑维全　邬华松　鱼欢

摘 要 连作障碍严重威胁中国胡椒优势种植区可持续发展，而土壤微生物多样性下降、群落结构失衡是连作障碍形成的重要原因之一。为了探明胡椒连作障碍与微生物多样性及群落结构变化之间的关系，揭示胡椒连作障碍形成的微生物机理，本文采用BIOLOG微平板法研究了海南万宁8、18和28 a 3种不同种植年限胡椒园土壤微生物群落功能多样性和群落结构变化。结果表明：随种植年限增加，不同园块之间稳定并达到最大的平均吸光度值（AWCD）呈明显下降趋势；香农指数、香农均匀度等多样性指数亦随种植年限增加呈显著下降趋势，而辛普森优势度指数无显著性差异；微生物群落结构随着年限增加出现了2次明显变化，第1次群落结构变化发生在8～18 a阶段，主要与酚酸类和多聚物类碳源利用微生物大幅减少有关，第2次则发生在18～28 a阶段，与碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类和胺类相关利用微生物减少有关。因此，胡椒连作显著降低了土壤中微生物多样性，改变了微生物群落结构，是胡椒连作障碍形成的重要原因之一。

关键词 胡椒；连作障碍；BIOLOG；微生物功能多样性；微生物群落结构

中图分类号 S182 文献标识码 A

Abstract Consecutive monoculture induces black pepper（Piper nigrum L.）poor growth， low yield， and serious soil-borne disease， thus becomes one of the most serious threats to the sustainable development of black pepper industry in China. To investigate its microbiological formation mechanisms， the soil samples from black pepper orchards with consecutive monoculture for 8， 18 and 28 years were analyzed by using the BIOLOG EcoPlates method and the responses of soil microbial functional diversity and community structure to different planting ages were demonstrated as follow. It revealed that average well color development（AWCD）obviously decreased with increasing planting duration. The same tendency was also demonstrated in soil microbial diversity indices， such as Shannon index， Shannon evenness index and Simpson index. In addition， the utilization of carbon sources by soil microbes from different planting duration showed significantly different. For example， the utilization rates of phenolic compounds and polymers obviously decreased during the period from the 8 th year to the 18th year and those of carbohydrates， amino acids， carboxylic acids and amines obviously decreased from the 18th year to the 28th year， which indicating the soil microbial community structure experienced two obvious changes with planting duration increasing. Furthermore， the principal component analysis（PCA）also showed the soil samples from the three planting duration were clearly separated from each other. These results suggested that consecutive monoculture of P. nigrum L. could decrease soil microbial activity and diversity， change the soil microbial community.

Key words Black pepper（Piper nigrum L.）； obstacle of consecutive monoculture； BIOLOG analysis； soil microbial functional diversity； community structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.010

胡椒（Piper nigrum L.）是世界古老而著名的香料，具有較高经济价值。据统计，2015年中国胡椒产业产值已超30亿元，其种植、生产和加工已成为热区100多万农民脱贫致富的特色作物产业[1]。受气候条件限制，中国胡椒主要集中在海南东部，种植面积和产量均占全国的90%以上，种植历史已达数十年。由于胡椒为多年生藤本植物，种植需以水泥柱或石柱作为支撑物，因而新垦胡椒园需要大量投入，这也造成种植时多以单一园块连续种植为主。近年来，随着种植年限增加，以单一连作为主要模式的海南优势种植区逐步出现连作障碍现象，表现为连作园补种幼苗生长缓慢，成龄植株长势弱，感病率增加，经济寿命缩短[2]。据调查，目前种植区内连续种植15 a以上的胡椒园约占50%，其中部分胡椒园甚至达到30～40 a，连作障碍已成为影响中国胡椒产业健康可持续发展的重要威胁之一[1-2]。

土壤微生物作为驱动土壤物质循环、能量流动的重要因子，参与了土壤酶和植物促生类物质生成、有机（自毒）物质分解、土壤固定态养分溶解等诸多土壤生物化学过程[3]。健康土壤中种类丰富且结构稳定的微生物群落能够保证各自微生物群落充分发挥自身功能，同时抵抗病原菌侵入，从而表现为较高生产力[4-5]；而长期连作土壤微生物多样性下降，微生物区系失衡，参与土壤过程的微生物类群和数量减少，抵御病原微生物侵入能力下降，从而造成土壤生产力衰退、植株长势差、病害多发等连作障碍现象[5-6]。因此，研究连作障碍形成过程中土壤微生物群落结构变化对构建健康稳定的土壤微生态环境具有重要意义，是连作障碍形成机制研究中的热点之一[7]。

前期对胡椒连作障碍的研究表明[2]，随着连作时间增加，土壤微生物总量出现下降，且主要为细菌和放线菌数量减少而真菌数量增加，因而导致群落结构由高肥的“细菌型”向低肥的“真菌型”转化，这与大豆、黄瓜、棉花等其它作物连作研究基本一致[4，6-9]。但群落结构变化过程中哪些微生物具体类群发生了变化尚不清楚，这些微生物类群变化与其它土壤物理、化学等连作障碍因子之间是否存在联系还有待进一步揭示。BIOLOG微平板法作为一种基于碳源代谢的微生物群落特性分析方法，不仅可以根据碳源代谢差异对土壤微生物进行分类，而且与磷脂脂肪酸PLFA法、分子生物学PCR-DGGE法、高通量454测序法等研究方法相比具有简单、快速、成本低等特点，目前广泛应用于土壤微生物群落功能多样性评价[10-11]。因此，本研究以海南胡椒种植区不同种植年限胡椒园土壤为研究对象，采用BIOLOG微平板法研究不同种植年限土壤微生物群落变化，以此明确随种植年限增加土壤中发生变化的具体微生物类群及其增减趋势，为明确胡椒连作障碍形成微生态学机制和探索防治措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验地点为中国热带农业科学院香料饮料研究所胡椒基地，地处海南省万宁市（18°1′N，110°13′E）。该地区属典型热带季风气候，年均温25 ℃，日照时数1 800～2 300 h，年均降水量2 100 mm，每年5～10月为雨季，当年11月到次年4月为旱季，土壤类型为砖红壤。该基地为研究所《胡椒栽培技术规程》（NY/ T 969-2006）标准示范基地，田间管理与施肥方式基本一致。土壤样品采集时间为2014年4月，样品分别来自该基地内种植年限为8、18和28 a胡椒园，品种为栽培种热引1号（印尼大叶种），面积各约0.2～0.27 hm2。取样时以对角线在园块内选取5～7个点做成1个混合样，每个样点重复采样3次。用小铲挖开每个点所在胡椒冠幅下土壤，取10～20 cm土层中根系，采用抖土法收集土样，完毕后放入冰盒后带回实验室。用于BIOLOG分析的土样放入4 ℃冰箱保存；用于土壤基础理化测定的土样置于室内通风阴凉处风干，过筛后备用。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性质测定 测定均采用常规方法[12]，具体如下：土壤pH值用电位法（土水比为1 ∶ 2.5）测定；土壤有机质用KCr2O7容量法-外加热法测定；速效氮用碱解扩散法测定；有效磷用0.03 mol/L NH4F-0.025 mol/L HCl浸提-钼锑抗比色法测定；有效钾用中性NH4OAc浸提-火焰光度法测定。

1.2.2 土壤微生物群落功能多样性测定 采用BIOLOG生态微平板（BIOLOG EcoPlateTM）测定。称取相当于10.00 g烘干质量的湿润土壤于250 mL三角瓶中，加入90 mL无菌去离子水，4 ℃下充分振荡1 h，静置3 min后用无菌去离子水配制成10-3土壤悬浮液。用8通道加样枪吸取此土壤悬浮液150 μL至ECO板的微孔中，每24 h測定590 nm处吸光度值，直至读数稳定为止，一般培养240 h。

1.3 数据处理与统计分析

利用每孔吸光度值计算平均吸光度值（average well colour development， AWCD），利用培养96 h的每孔吸光度值计算香农指数（Shannon index）、香农指数均匀度（Shannon evenness）和辛普森优势度指数（Simpson index）等多样性指数，具体计算方法参见杨永华等[13]和张志明等[14]，数值计算出后，采用单因素方差分析不同种植年限间的显著性差异；以96 h的每孔吸光度值进行主成分分析（PCA）。单因素方差分析和主成分分析均利用SPSS 19.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 胡椒连作对土壤基础理化性质的影响

由表1可知，随着种植年限增加，土壤pH和有机质含量均呈显著下降趋势，其中8～18 a和18～28 a阶段土壤pH分别下降0.22和0.36个单位，有机质含量分别减少0.37 g/kg和2.35 g/kg，表明土壤pH和有机质含量随连作时间增加，受影响程度越大；土壤速效磷呈上升，速效钾则下降趋势，而速效氮含量无显著差异，这可能与胡椒施肥过程中施入的氮磷多而钾肥少，引起连作胡椒园土壤养分失衡有关。

2.2 连作对胡椒园土壤微生物群落功能多样性的影响

2.2.1 土壤微生物群落碳源利用能力分析 平均吸光度值（AWCD）是表征土壤微生物群落利用碳源能力强弱，反映碳代谢总体活性的重要指标[15]。不同种植年限处理的AWCD值随着培养时间增加均呈“S”型增加（图1所示），其中24～96 h AWCD增加速率最快，96 h后不同处理间碳代谢活性逐步达到最大且趋于稳定；不同处理间AWCD最大值存在差异，表现为8 a>18 a>28 a，表明随着连作时间增加，土壤微生物群落碳源利用能力下降，总体碳代谢活性降低。

2.2.2 多样性指数分析 采用培养96 h的平板微孔吸光度值，计算不同种植年限下土壤微生物群落功能多样性指数及均匀度。结果表明，随着种植年限增加，香农指数、香农均匀度和辛普森指数均呈下降趋势。其中，18 a和28 a处理的香农指数较8 a处理分别下降19.1%和74.9%，香农均匀度指数分别下降26.3%和63.1%；而辛普森指数仅分别下降3.1%和9.3%（见表2）。显著性分析表明，香农指数和香农均匀度指数在不同种植年限处理之间达到显著水平（p<0.05），而辛普森指数在不同处理间无显著性差异（见表2）。

2.2.3 土壤微生物对不同类型碳源利用的差异

按化学官能团的性质对ECO板上的31种碳源分成6类[16]，即糖类及其衍生物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸类和胺类，将每类碳源的吸光值平均后进行分析。从图2可知，不同种植年限土壤微生物对不同碳源的利用程度差异较大，说明随着连作时间增加，土壤微生物群落結构发生了变化。其中，利用多聚物类和酚酸类碳源的微生物最先受到影响，从8 a到18 a这一阶段2类微生物有较大程度降低，而此后下降程度不大；而碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类和胺类等碳源利用微生物则在18 a后受连作影响较大，因而表现为28 a明显下降。

2.3 土壤微生物群落功能多样性主成分分析

采用培养96 h的平板微孔吸光度值进行主成分分析，提取2个主成分因子并做荷载图（如图3）。2个主成分因子累计方差贡献率达到85.71%，说明2个主成分因子可以很好地解释不同种植年限土壤之间的绝大多数差异。其中第1主成分（PC 1）的方差贡献率为78.99%，第2主成分（PC 2）的方差贡献率为6.72%。在PC 1轴上，8 a、18 a和28 a分别分布于轴的正值区、零点区和负值区；在PC 2轴上，18 a主要分布于正值区，而8 a和28 a分布在负值区。因此，利用主成分分析可以很好地将8、18和28 a土壤微生物群落结构分别划分在荷载图第4、第1和第3象限，进一步表明胡椒土壤微生物群落结构随着种植年限增加出现了明显变化。

分析31种碳源在2个主成分上的荷载值如表3所示。从表中可知，对第1主成分（PC 1）贡献较大的碳源主要包括D-半乳糖酸内酯等9种碳水化合物类碳源、L-精氨酸等4种氨基酸类碳源和r-羟基丁酸等4种羧酸类碳源；对第2主成分（PC 2）贡献较大的碳源则主要包括N-乙酰基-D-葡萄胺等2种胺类碳源。由于PC 1方差贡献率为78.99%，表明引起连作胡椒土壤微生物群落结构变化的主要种群即碳水化合物类、氨基酸类和羧酸类这3类碳源利用微生物。

3 讨论

随着土地资源日益紧张，中国农业生产中土地利用强度不断加大，土壤连作障碍现象已十分普遍[17]。连作通常导致作物生长发育不良，品质及产量下降，抗病能力降低。尽管其形成原因较多，但土壤中微生物多样性下降、群落结构失衡被认为是导致土壤生产力下降、作物减产的重要原因之一[8-9，18]。

3.1 胡椒连作对土壤微生物群落功能多样性的影响

连作土壤一般伴随着土壤微生物群落功能多样性降低。时鹏等[19]利用BIOLOG法研究玉米连作土壤表明，连作土壤微生物群落功能多样性显著低于非连作土壤。岳冰冰等[20]研究发现，烟草连作7年土壤微生物功能多样性显著低于连作2年处理。张重义等[17]对地黄连作研究表明，随着种植年限增加，土壤微生物群落多样性呈下降趋势。前期对胡椒连作的研究表明[2]，随着胡椒种植年限增加，土壤微生物总量逐年下降。本研究利用BIOLOG法也发现，表征31种碳源利用程度的平均吸光度值（AWCD），在不同种植年限土壤之间随连作时间增加明显下降（图1），表明连作土壤微生物群落碳代谢整体能力下降，土壤微生物群落功能多样性降低，与上述研究结果一致。

多样性指数也反映了微生物群落功能多样性变化。而且，不同指数反映多样性不同侧面，香农指数和香农均匀度主要反映群落物种个体数和分布均匀度，而辛普森指数反映群落中最常见类群的优势度[10-11，21]。本研究中香农指数和香农均匀度结果与AWCD一致，均随连作时间增加显著下降，表明微生物功能多样性随年限增加而下降；但辛普森指数在种植年限间差异不显著，表明该过程中微生物优势种群可能未发生明显变化，又根据不同类型碳源利用微生物随种植年限的变化差异可知（图2），碳水化合物类、氨基酸类和羧酸类等碳源利用微生物受种植年限影响程度较小，是胡椒根际中的优势微生物种群。

3.2 胡椒连作对土壤微生物群落结构的影响

土壤微生物群落功能多样性反映了群落总体情况，而土壤微生物对不同类型碳源利用的差异，则反映了土壤微生物群落的结构组成变化[22]。本研究中，6类不同碳源利用微生物AWCD值均随连作时间增加呈下降趋势，但出现较大下降的阶段存在不同：酚酸类和多聚物类碳源利用微生物出现大幅下降时间相对较早，在连作8～18 a时即明显下降；而碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类和胺类等则相对较晚，到连作18～28 a才有明显下降。因而分析不同微生物类群对胡椒连作障碍形成的影响程度，可以更好地理解胡椒连作障碍形成原因。

Badri等[23]利用拟南芥根系分泌物不同组分培养土壤微生物发现，与其它碳源类组分相比，酚酸类利用微生物物种丰富度更高，对于土壤微生物多样性和群落组成具有重要意义。本研究中8～18 a阶段酚酸类和多聚物类利用微生物活性大幅降低，表明这一时期连作胡椒土壤微生物多样性出现了第1次明显下降；而且，与其他碳源利用微生物相比，这2类微生物活性大幅下降的时间相对较早，说明其适应外界环境变化的能力相对较弱，在今后研究中，可将相关微生物活性开始大幅下降阶段作为胡椒连作障碍初始发生的重要信号。

本研究中，18～28 a阶段碳水化合物类、氨基酸类和羧酸类等碳源利用微生物大幅下降，说明这3类微生物适应外界环境变化的能力相对较强。尽管如此，随着连作年限增加，土壤pH等微生态环境不断恶化，最终造成这些优势微生物活性减弱，此时土壤连作障碍问题也更加明显。

3.3 土壤微生物群落功能多样性与胡椒连作障碍的关系

土壤微生物群落结构越复杂，物种越均匀，多样性越丰富，其抑制病原菌能力越强[5，24]。如Irikiin等[25]研究发现，番茄青枯病发病率与BIOLOG ECO板中碳源利用数目呈负相关。董艳等[26]研究也表明，提高土壤微生物多样性可以显著降低蚕豆枯萎病的发生。目前认为，微生物群落多样性的抑病机理可能与根际生态位竞争[27-28]或者微生物间碳源营养竞争[28-29]有关。在本研究中，连作胡椒土壤微生物群落功能多样性下降，也与实际生产中老龄园病害易发、产量下降等问题具有一致性。而且研究表明，通过合理施用化肥[30]，增施有机肥[31]或有机生物肥[32-33]，采取轮作[34]或间作[35]等大田管理措施来提高根际微生物多样性，可以有效缓解连作障碍，为今后解决胡椒连作障碍问题提供了参考。

3.4 不同碳源利用微生物与胡椒连作障碍

由前述分析已知，酚酸类利用微生物活性下降是胡椒连作障碍开始的重要信号。但引起连作障碍的原因除了酚酸类利用微生物大幅减少会造成土壤微生物多样性下降、群落结构失衡外，还可能与其大幅减少引起胡椒根际中酚酸类物质积累有关。大豆、烟草等研究已表明，酚酸类物质是重要的化感物质，长期连作导致其在土壤中累积是造成连作障碍发生的重要原因[36-37]。本研究中，酚酸类碳源利用微生物在8～18 a时大幅减少，表明此时胡椒根际中酚酸类物质分解速率将大大降低，未被分解利用的酚酸类物质在土壤中大量累积，从而表现为较强的化感作用。国外也有报道[38]，巴西、泰国、马来西亚等胡椒主产国在胡椒种植15 a左右时就会轮作，否则胡椒产量就会大幅降低，进一步证实了15～18 a这一阶段是胡椒连作障碍开始发生的主要时期。但该时期连作障碍形成机制仍需在今后研究中取得更直接的证据予以证实。

碳水化合物、氨基酸和羧酸类碳源利用微生物也与连作障碍形成密切相关。碳水化合物类物质是根际微生物利用最广泛的碳源，其利用微生物减少表明土壤微生物整体多样性下降。精氨酸、天冬酰胺酸、苯丙氨酸等氨基酸可以促进尖孢镰刀菌等病原菌孢子萌发和菌丝生长，使得根际微环境有利于病原菌生长，引发植株病害[39]。羧酸类利用微生物减少会造成植物根际有机酸分解减缓，加速根际酸化，如本研究中8～18 a和18～28 a阶段土壤pH分别下降0.22和0.36个单位；当根际酸化程度过大则会抑制根系生长，影响作物水分和养分吸收，引起作物长势变差。因此，当参与众多土壤生物化学过程的微生物种群大幅减少时，其维持土壤物质循环与能量流动的能力也相应下降，土壤微生态环境逐步恶化，从而表现出较严重的连作障碍问题。

3.5 小结与展望

本研究采用BIOLOG微平板法研究了不同种植年限胡椒园土壤微生物功能多样性和群落结构的变化，结果表明，随种植年限增加，胡椒园土壤微生物功能多样性降低，群落结构发生显著变化，同时土壤pH值明显下降，养分逐渐失衡，这些因素共同作用是导致胡椒连作障碍形成的主要原因。但由于BIOLOG法培养的微生物只占自然完整微生物中的10%[7]，不能完全反映连作障碍形成过程中所有微生物群落变化等信息[40]。因此，今后需采用更先进的研究方法，如454、Illumina等高通量测序技术来开展相关研究[10]，为揭示胡椒连作障碍形成中微生物参與机制提供更加直接、明确的证据。

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