肉饼兜兰叶片生长模型与解剖结构研究

张英杰　初美静　刘学庆　张京伟　郭文姣　刘述河　孙纪霞

摘 要 以2种肉饼兜兰为试材，研究其叶片生长发育规律和解剖结构。结果表明：兜兰叶片生长动态呈现S型生长曲线，生长周期长，叶片寿命长。兜兰的叶片长度、宽度和叶面积随苗龄增大而增大，萌发新叶的间隔时间随苗龄增大而增长，新叶的发育周期随苗龄增大而增长。兜兰的表皮细胞厚，而叶肉细胞厚度低，叶片组织结构紧密度低，可能是导致兜兰虽为C3植物但是营养生长速度慢的原因。兜兰的叶片厚、上表皮细胞巨大、角质层较厚、气孔下生型和龙骨状主叶脉发达，具有明显的旱生特点。

关键词 兜兰；叶片；生长曲线；解剖结构

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract The leaf growth model and anatomical structure was analyzed and observed on 2 cultivars of Paphiopedilum pacific. Results showed that the leaf growth dynamics were both“S”-type curve， and the leaf had a long growth cycle and lifetime. Older leaf， longer leaf length led to longer time needed to germinate a new leaf and fully develop. The adaxial epidermis was thick， while the mesophyll cell was thin， so its organizational structure closely degree was low， which might lead to its slow growth， though it belonged to C3 plant. Paphiopedilum pacific had thick leaves， and its adaxial epidermis was big and cuticula was thick， and also， its sunken stomata and developed carinate veins illustrated that Paphiopedilum had an obvious drought characteristic.

Key words Paphiopedilum pacific； leaf； growth curve； anatomical structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.009

兜兰属（Paphiopedilum），是兰科（Orchidaceae）的一类濒危植物，畅销于国际花卉市场，其观赏价值和经济价值极高[1]，2016年大花型黄绿色兜兰（Paphiopedilum Emerald Furture‘Galaxy）一举荣获日本世界兰花展总冠军。国际上兜兰的主流商业品种也是大花型绿色和红色的肉饼类品种。我国兜兰市场处于起步阶段，发展空间大，但在我国设施栽培生产中，大花型肉饼类兜兰存在营养生长的生长周期过长、生长速度过慢等缺点，设施栽培周期长达3～5 a，导致生产成本较高，风险较大。因此，研究大花型肉饼类兜兰为何叶片生长如此之慢，对提高兜兰设施栽培效率具有重要科学意义。

叶片生长发育直接影响植株长势和开花品质[2-3]，外界环境的变化会导致叶片的长、宽、厚度及叶表组织、叶肉组织等结构的相应变化[4-8]。目前，国内对部分中国兰和热带兰的生长发育规律进行了部分研究[9]，但有关兰科植物叶片生长模式和形态结构的研究报道较少。李艳[10]研究发现春兰、春剑、莲瓣兰和建兰的叶片生长动态与其他植物一般生长动态相同，均呈S型生长曲线，但不同的种之间有所不同。张京伟等[11]研究发现蝴蝶兰营养生长期间叶片总面积S与积温T呈二次函数关系。Jin等[12]研究了4种蝴蝶兰叶片生长曲线并建立了叶间期指数公式。在其他植物叶片生长发育规律的研究中，也有几何参数的模型的建立[13-14]，但尚未见兜兰叶片生长发育模型的建立。有研究发现兜兰属野生种因不同生境类型而对水分和光照的适应性表现出差异显著[15]。孙安慈[16]对石斛属、兰属和兜兰属研究，发现其表皮细胞形态、纹饰和叶肉组织分化存在差异。目前兜兰叶片解剖结构的研究主要针对我国野生种，未见商业品种相关研究报道。

本研究以商业品种肉饼类兜兰为试材，研究其叶片生长模式和叶片解剖结构，分析其生长规律和造成生长速度过慢的原因，以期解决目前我国兜兰设施栽培生产中生长周期长的难题，为提高兜兰设施栽培效率和成品率等研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试兜兰属品种为绿肉饼（Paphiopedilum pacific Cocoa Lovely）、红肉饼（P. pacific In-Charm Circle），试验于2013～2016年于山东省烟台市农业科学研究院的连栋温室（地理位置37°29′2″N，121°16′26″E，海拔6 m）进行。

1.2 方法

选取1 000株肉饼兜兰瓶苗，出瓶后栽培于直径5.67 cm透明营养钵中，基质为松树皮（直径3～7 mm）。在湿度80%，温度18～28 ℃（昼）、15～18 ℃（夜），光照强度10 000～15 000 lx的条件下栽培管理。养护1 a后，将株幅大于9 cm的小苗换盆至直径8.33 cm透明营养钵中进行中苗期养护。栽培1 a后，将株幅大于22 cm的中苗兜兰植株换盆至直径10 cm的透明营养钵中进行大苗期养护。

筛选50株长势基本一致、健康无病虫害的绿肉饼瓶苗，从兜兰组培苗出瓶开始，每个月测量50株兜兰每片叶片的长度、宽度和叶面积，求平均值，连续测量35个月。栽培3 a后，红绿肉饼分别选择10个健康样本，以1～2 年生健康成熟叶片为试材，切割下来，洗净擦干，用刀片、解剖针和镊子沿靠近葉片中脉附近撕下上下表皮1.5 cm×1.5 cm，无需染色，制作徒手装片。在OLYMPUS IX51显微镜下观察切片中叶片的上下表皮和气孔器形态。用索尼相机（NEX F3）拍照，并用测量尺和图形分析软件（Adobe photoshop）随机测量10个视野中叶片的总厚度、上下表皮的厚度、上下表皮角质层的厚度、叶肉组织（栅栏组织和海绵组织）的厚度、气孔的大小、主叶脉维管束的大小等，并对数据进行统计分析。

1.3 数据分析

用统计软件Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0对兜兰叶片的形态指标进行分析，绘制叶片生长曲线。其中，叶片组织结构紧密度CTR=栅栏组织厚度/叶片厚度，气孔指数（I）的统计采用公式I=S/（E+S）×100%计算（S：气孔数，E：表皮细胞数），气孔密度=固定面积内气孔个数/固定面积。单个气孔器的面积（As）采用公式As=1/4×π×l×w计算（l：气孔器长，w：气孔器宽）。

2 结果与分析

2.1 兜兰叶片生长曲线

由兜兰的叶片生长曲线（图1）可见，兜兰叶片生长速度较慢，生长周期长，叶片寿命相对较长。兜兰的叶片长度随苗龄增大而增大，叶片生长速度呈现“慢-快-慢”的特征，叶片生长动态呈现S型生长曲线。萌发新叶的间隔时间随苗龄增大而增长，新老叶片同时生长，新叶的发育周期随苗龄增大而增长。小苗叶片长度小于10 cm，每30 d萌发下一片新叶，每个叶片需要90 d完成生长，叶片寿命长达480～660 d。中苗期兜兰叶片长度10～20 cm，间隔60～90 d萌发下一片新叶，每个叶片需240～270 d才能完全停止生长，叶片寿命大于780 d。大苗期兜兰的叶片长度大于20 cm，间隔120 d萌发下一片新叶，每个叶片需要长达300 d才能完成生长发育过程。

图1中leaf 1～3是组织培养期间生长的叶片，组培苗出瓶后栽培于树皮基质中，30 d后开始萌发新根，60 d开始萌发新叶。因出瓶后环境因子改变，部分能量供给根部发育，因此萌发的第一片新叶leaf 4～5的最终发育长度小于leaf 3的长度，但之后生长的叶片长度均大于组培苗期间的叶片长度，且新发叶片长度均大于老叶。leaf 4～6为小苗期发育叶片，leaf 7～10为中苗期发育叶片，leaf 11～12为大苗期发育的叶片。多数兜兰栽培3 a后具有开花能力，并开始萌蘖新芽。生殖生长开启后能量流动去向发生变化，更多的能量供应给生殖生长和萌蘖新芽。

图2为兜兰营养生长过程中叶片的长宽和面积变化曲线，虽然leaf 4、5的叶片长度小于leaf 3，但叶片宽度和叶片面积均不小于leaf 3。组培苗期间发育的叶片形状相对细长，而温室栽培发育的叶片形状相对钝圆，因此新发育的叶片即使叶长变小，但叶宽和叶面积在增长。leaf 6～11的叶面积增长斜率最大，说明兜兰的中苗期进入快速增长阶段。

2.2 大花兜兰叶片解剖结构特征

兜兰叶片的解剖结构见图3、4，肉饼兜兰为绿叶类，上下表皮细胞均无色。兜兰气孔器分布在下表皮中，上表皮不含气孔。气孔呈椭圆形，保卫细胞均无叶绿体。兜兰的上下表皮细胞形态有区别，上表皮细胞呈现规则蜂窝状5～7边形，多6边形，而下表皮细胞呈现不规则4～7边形。由图可见，兜兰的上表皮细胞显著大于下表皮细胞，厚度显著大于下表皮细胞。表1数据表明，肉饼兜兰叶片厚度均大于700 μm，平均厚度为777.79 μm。兜兰上表皮细胞巨大，近中脉处最厚，占叶片总厚度的比例为30%～40%。上表皮细胞显著大于叶肉细胞和下表皮细胞。兜兰叶片的上表皮角质层呈乳突状凸起，较厚，大于20 μm，下表皮角质层相对薄。栅栏组织厚度小，多为1～2层长柱形细胞。海绵组织细胞为不规则形，排列相对疏松，厚度比栅栏组织大。兜兰的叶片组织结构紧密度相对低，其中绿肉饼的CTR值较高，红肉饼相对较低。叶片的主叶脉发达，成龙骨状，具有较好的支撑作用，但是其他叶脉不发达。肉饼兜兰的气孔属于下生型，平均气孔指数为17.49%，平均气孔密度为51.47个/mm2，平均气孔面积为2 253.49 μm2。

3 讨论

兜兰叶片生长动态同其他植物[17-18]，叶长和叶面积呈现S型增长曲线，其中苗期为营养生长快速增长期。兜兰叶片生长周期长，从小苗到成熟苗的叶片生长周期由90 d增加至300 d。与兰科其他花卉相比，莲瓣兰10 cm长叶片生长周期为170 d，建兰12 cm长叶片生长周期为150 d，春剑18 cm长叶片的生长周期为190 d[17]，蝴蝶兰叶片生长周期为45～50 d[11]，而兜兰成熟叶片生长发育需时可长达240～300 d。兜兰营养生长缓慢，对我国兜兰产业化生产推广、新品种培育和科研工作都是一个瓶颈问题。如何解决兜兰生长周期过长的问题将成为今后科研工作的重点和难点。

兜兰特殊的叶片组织结构可能是导致其营养生长速度过慢的原因。虽然兜兰属于C3植物[19]，但与其他典型C3植物小麦和大豆相比较，兜兰生长速度明显过慢。本试验发现肉饼兜兰叶片平均厚度为777.79 μm，分别是C3植物小麦[20]的4.21倍和大豆[21]的3.97倍。同时，兜兰的叶片组织结构平均紧密度非常低，仅为0.17，而大豆的叶片组织结构平均紧密度可达0.53[21]。巨大的表皮细胞占了兜兰叶片总厚度的大部分，而可以进行光合作用的叶肉细胞厚度相对过低，尤其是栅栏组织含量过低。兜兰光合作用产生的能量合成大量的脂类，为其角质层的发育提供原材料。因此，叶肉组织，尤其是栅栏组织比例小，光合作用产物的来源减少，而巨大的表皮细胞的发育消耗了大量光合作用产物。这种特殊的叶片组织结构导致光合产能降低，可能是导致其营养生长速度过慢的原因。

兜兰特殊的叶片组织结构具有明显的旱生特点：叶片厚、巨大的上表皮细胞、较厚的角质层、气孔下生型和发达的龙骨状主叶脉。植物的叶片表皮细胞一般起保护作用，而较厚的角质层可以防止植物过分失水。兜兰巨大的上表皮细胞可能和其他兰科植物相同，具有储存水分的功能[22]。兜兰符合兰科植物气孔下生型特点，可使其适应于干旱环境[23]，但也減少了CO2进入叶片和在叶肉细胞中扩散的途径。发达的龙骨状主叶脉有较强的支撑作用，能防止叶片在失水状态下造成物理损伤。兜兰分布于我国西南部的喀斯特石灰岩地区，这些地区降雨丰富，但是水土易流失，土壤层浅薄、渗透性强、含水量低[24]。与旱生植物研究结果相吻合[25-27]，兜兰特殊的叶片组织结构具有明显的旱生特点，能保证其在水肥易流失的土壤环境中维持正常的生理代谢。

综上所述，兜兰营养生长速度过慢可能是由其特殊的叶片结构造成的，而其特殊的叶片结构是应对原产地干旱土壤而长期进化形成的。随着兜兰市场的不断扩大，今后的研究方向在提高兜兰叶片生长速度的栽培技术研究基础上，展开生长发育相关的生理和分子调控机制研究，对于开发兜兰盆花市场具有重要的理论价值和指导意义。

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