火龙果茎多糖的超高压提取及抗氧化活性研究

郭淼　宋江峰　王传凯

摘 要 为研究火龙果茎多糖的超高压提取工艺及抗氧化活性。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计和响应面分析方法，确定超高压提取的最优工艺，并从清除ABTS自由基和DPPH自由基能力方面来评价火龙果茎多糖的体外抗氧化能力。结果表明，火龙果茎多糖的超高压提取的最佳工艺条件为：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高压压力300 MPa、超高压时间4 min。在此工艺条件下多糖得率为（2.83±0.02）%。火龙果茎对ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，对ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分别为浓度为4.3 mg/mL和5.5 mg/mL时。

关键词 火龙果茎；多糖；超高压；抗氧化

中图分类号 TS201.1 文献标识码 A

Abstract To study the technology of ultra high pressure extraction and analysis its antioxidannt activity of polysaccharides from pulp pitaya stem， on the basis of single factor experiments， the optimal processing conditions were determined by means of response surface analysis and Box-Behnken design. The results showed that the optimum extraction conditions of the polysaccharides from pulp pitaya stem were as follows： liquid to solid ratio10 ∶ 1（mL/g）， pressure 300 MPa and extraction time 4min. Under the conditions， the extraction yield of the polysaccharides from pulp pitaya stem reached（2.83±0.02）%. The polysaccharides from pulp pitaya stem had the ABTS and DPPH scavenging activity. The mass concentration of IC50 was 4.3 mg/mL and 5.5 mg/mL， respectively. This study could provide useful references for the development and exploitation of the polysaccharides from pulp pitaya stem.

Key words pulp pitaya stem； polysaccharides； ultra high pressure； antioxidant

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.030

火龙果（Hylocerus undatus），为仙人掌科量天尺属植物，其营养丰富，含有多糖、黄酮、皂苷、植物甾醇、黄酮等活性成分[1-3]，近年来，在我国南部区域海南省、广西自治区等大量栽种。火龙果采摘后的茎杆为火龙果茎，富含多糖等活性成分[4-6]，目前往往作为废弃物丢弃，不仅污染环境，还造成资源浪费。因此，对火龙果茎多糖进行提取利用，可提高火龙果种植的经济效益，对火龙果的开发利用具有重要意义。

目前，火龙果茎多糖的提取方法为热水浸提法，其提取时间长，提取温度高，得率低；何聪芬等[7]采用热水浸提法提取火龙果茎多糖，提取得率仅为0.96%。近年来，一些研究者研究强化多糖提取的方法。超高压提取作为一种新型的提取方法，在多糖的提取上得到研究，王新新等[8]采用超高压提取瓜蒌多糖，Bai等[9]采用超高压提取龙眼多糖，但采用超高压提取火龙果茎多糖尚未见报道，对其抗氧化活性也缺乏研究。因此，本实验在单因素试验基础上，采用响应面法优化超高压提取火龙果茎多糖的最佳工艺参数，同时对其进行抗氧化活性研究，以期为火龙果茎的开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为‘黔果2号火龙果茎，2015年11月采自海口市郊，采摘后清洗、置冰箱中冷藏备用；D-葡萄糖、苯酚、浓硫酸来自北京谱析科技有限公司；DPPH、ABTS来自美国sigma公司，以上试剂均为分析纯。

751-GD紫外可见光分光光度计（上海分析仪器总厂）、RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、UHP900×2-Z超高压处理装置（包头科发公司）。

1.2 方法

1.2.1 超高压提取火龙果茎多糖 称取一定量的火龙果茎，切碎，加入不同体积纯水，装入聚乙烯塑料袋，混合均匀后真空封口，将包装后的塑料袋放入超高壓装置的工作介质中，在设定压力下超高压处理一定时间后，取出，提取液在4 000 r/min离心20 min，上清液真空浓缩后，加入无水乙醇，使乙醇浓度达到85%，然后放在4 ℃的冰箱中过夜，移去上层上清液，将下层沉淀冷冻干燥，即为火龙果茎粗多糖。

1.2.2 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[10-11]。

1.2.3 超高压提取火龙果茎多糖工艺条件的优化

以多糖的得率为指标，采用单因素法，以液固比（5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1）（mL ∶ g）、超高压压力（100、200、300、400 MPa）（0.1 MPa作为对照）、和超高压处理时间（2、3、4、5、6 min）为影响因素，考察其对多糖得率的影响。在单因素实验基础上，采用Box-Behnken设计，选择液固比、超高压压力和超高压处理时间为自变量，以多糖的得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.5b软件进行响应曲面分析，优化提取条件，因素与水平表见表1。

1.2.4 清除ABTS自由基能力测定 采用WANG等方法并进行适当调整[12]，将7 mmol/L的ABTS与2.45 mmol/L的过硫酸钾混合，放在暗处16 h，得到ABTS自由基离子；在734 nm下将离子溶液的吸光值调整为0.700±0.02，30 ℃下平衡30 min；然后将2.0 mL ABTS离子液和0.2 mL待测样品在室温混合均匀，反应20 min后，于734 nm处测定吸光值，ABTS自由基清除能力C1为：

1.2.5 DPPH自由基清除活性 采用WANG等方法并进行适当调整[12]，将3 mL 0.1 mmol/L DPPH（95%乙醇配成），加入2 mL待测样品，在室温下避光保持30 min后，采用517 nm测定吸光值。按下式计算DPPH自由基清除率C2（%）。

1.2.6 数据处理 所有实验重复3次，实验数据表示为mean±S，采用SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液固比对火龙果茎多糖得率的影响 不同液固比对火龙果茎多糖得率的影响结果如图1所示，液固比在5 ∶ 1～15 ∶ 1之间时，多糖得率随溶剂用量的增加而迅速提高，液料比达到15 ∶ 1后，得率变化不显著（p>0.05）。因此液固比以15 ∶ 1（mL ∶ g）为宜。

2.1.2 超高压压力对火龙果茎多糖得率的影响

不同超高压压力对火龙果茎多糖得率的影响结果如图2所示，随着超高压压力的增加，超高压压力对细胞壁的破碎作用增强，火龙果茎多糖溶出速率增大，得率逐渐增加，超高压压力过300 MPa时，得率变化不显著（p>0.05）。可能是该压力已经将细胞完全破坏。因此超高压压力以300 MPa为宜。

2.1.3 不同超高压时间对火龙果茎多糖得率的影响

不同超高压时间对火龙果茎多糖得率的影响如图3所示，在2～4 min时，多糖得率随着时间的增加而迅速提高，达到4 min后，得率随后有所下降。其原因可能是随着超高压时间的增加，超高压下细胞破碎度逐渐增大，过多碎片阻碍多糖溶出，导致得率下降。

2.2 响应面优化超高压提取工艺

2.2.1 响应面实验设计与结果 在单因素实验的基础上，以火龙果茎多糖得率为指标，液固比（A）、超高压压力（B）和超高压时间（C）为因素，进行三因素三水平17个实验点的响应面试验，实验设计及结果见表2。

运用Design Expert 8.0.5b数软件对表2实验结果进行多元回归拟合，得火龙果茎多糖得率与各因素的二次多项式回归模型为：Y=2.84+0.048A+0.026B-0.079C-0.075AC+0.017BC-0.16A2-0.39B2-0.13C2回歸模型进行方差分析和回归系数显著性检验结果见表3，从表3可以看出，该二次回归方程模型极显著（p<0.000 1），模型的相关系数R2=0.928 6，表明该模型可以解释92.86%的响应值Y的变化。回归方程的相关系数（R2=0.928 6， Adj-R2=0.968 7，Pred-R2=0.824 6）及变异系数CV（2.71%）均表明模型方程能够较好地反映真实的试验值。 该方程与实际情况拟合很好，较好地反映了多糖得率与液料比、超高压压力300 MPa、超高压时间的关系；模型一次项B对响应值Y影响显著（p<0.05），二次项对响应值Y影响都极显著（p<0.01），说明分析结果可靠；模型交互作用不显著。根据F值大小，可知各因素对火龙果茎多糖得率影响的程度依次是超高压时间>液料比>超高压压力。

响应曲面图见图4。从图中可以看出，2个参数之间的相互作用对得率影响的响应面分析图为山丘曲面时，特征值为正值，均有极大值存在；而等高线均为椭圆形，表示两两相互作用显著。

2.2.2 验证实验 运用Design Expert 8.0.5b软件对实验结果进行优化分析，确定最佳提取条件为：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高压压力300 MPa、超高压时间4 min，在该提取条件下，预测火龙果茎多糖得率可达到2.84%。采用上述优化条件进行3次验证实验，火龙果茎多糖得率实测值为（2.83±0.02）%，表明实测值与预测值基本吻合，该模型能较好的预测超高压提取火龙果茎多糖得率。

2.2.3 与传统热水浸提法的对比 按文献报道的传统热水浸提法进行提取火龙果茎多糖[6]，火龙果茎多糖的工艺条件为：液料比20 ∶ 1、温度80 ℃、提取时间4 h，提取3次，在此条件下，火龙果茎多糖得率为 1.02%。在本研究所得最佳的工艺条件下，火龙果茎多糖得率为 2.84%，不仅比传统热水浸提法得率提高2.8倍，且提取时间由4 h减少为4 min。说明该方法不仅得率高，且提取时间短，可有效地应用火龙果茎多糖的提取。

2.3 超高压提取火龙果茎多糖抗氧化实验

2.3.1 ABTS自由基清除率 火龙果茎多糖对ABTS自由基清除率的测定结果见图5。由图5可知，超高压提取和常规热水提取的火龙果茎多糖对ABTS自由基的清除率随样品浓度升高而增大；但相对于同浓度的Vc溶液相对较弱，超高压提取的火龙果茎多糖对ABTS自由基清除率IC50的浓度为4.3 mg/mL，常规热水提取的火龙果茎多糖对ABTS自由基清除率IC50的浓度为4.4 mg/mL。二者相差不显著。

2.3.2 DPPH自由基清除率 火龙果茎多糖对 DPPH自由基清除率的测定结果见图6。由图6可知，超高压提取和常规热水提取的火龙果茎多糖对DPPH自由基的清除率随样品浓度升高而增大；但相对于同浓度的Vc溶液相对较弱，火龙果茎多糖对DPPH自由基清除率IC50的浓度为5.5 mg/mL。常规热水提取的火龙果茎多糖对DPPH自由基清除率IC50的浓度为5.9 mg/mL，二者相差不显著。

3 讨论

目前，传统火龙果茎多糖采用传统热水浸提法，提取温度80 ℃、提取时间需要4 h，火龙果茎多糖得率仅为1.02%。而本研究采用超高压提取工艺提取火龙果茎多糖，提取溶剂仍为水，但采用超高压处理强化提取过程，不仅提取得率高，而且时间短，通过单因素和响应面优化结果得到多糖提取的优化条件为液料比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高压压力300 MPa、超高压时间4 min。在此工艺条件下多糖得率为（2.83±0.02）%。超高压提取之所以具有较高的提取得率和较短的提取时间，是因为在超高压下，火龙果茎中的细胞被高压作用后导致细胞快速破裂，破裂的细胞中的多糖得以容易释放。压力越高，细胞越容易破坏，但当压力达到300 MPa后，细胞已经破坏完全，因此，继续增加压力，细胞也不再破裂，导致得率不再增加[13-14]；在相同的压力下，压力维持时间越长，细胞越容易破坏，但当时间达到一定数值后，细胞已经破坏完全，因此，继续增加时间，细胞也不再破裂，得率不再增加。此外，根据传质理论，加压处理能够细胞的渗透性增加，同时，根据相变理论，生物活性成分的溶解度随着压力增加而增加，因此超高压处理加快了传质过程[15]。

许多植物多糖均具有较强的抗氧化活性，本研究发现火龙果茎对ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，对ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分别为浓度为4.3 mg/mL和5.5 mg/mL时。表明火龙果茎多糖也具有抗氧化作用。但目前对于火龙果茎多糖的研究尚处于初级阶段，后续需要对其结构鉴定和药理性质进行进一步研究，为龙果茎多糖开发提供技术支持。

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