前列腺素E1后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用*

王玉柱，明英姿

[1.郑州大学人民医院（河南省人民医院）肝胆胰腺外科,河南郑州450003；2.中南大学湘雅移植医学研究院，湖南长沙410013]

前列腺素E1后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用*

王玉柱1，明英姿2

[1.郑州大学人民医院（河南省人民医院）肝胆胰腺外科,河南郑州450003；2.中南大学湘雅移植医学研究院，湖南长沙410013]

目的探讨前列腺素E1（PGE1）后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤（IRI）的保护作用及其机制。方法建立SD大鼠肝移植模型，随机分为3组：IRI组、PGE1后处理组（PGE1组）及假手术组（S组）。检测各组血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物岐化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量；采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测移植肝组织内肿瘤坏死因子（TNF-α）信使核糖核酸（mRNA）的表达水平；苏木精-伊红染色（HE）观察移植肝病理形态学变化。结果供肝再灌注后2及6 h，PGE1组的大鼠血清ALT、AST和MDA水平及TNF-α mRNA的表达低于IRI组（P＜0.05），血清SOD水平高于IRI组（P＜0.05），光镜下PGE1组肝组织损伤较IRI组轻。结论PGE1后处理可通过提高肝组织的抗氧化能力，降低TNF-α来减轻大鼠移植肝IRI。

肝移植；缺血再灌注损伤；药物后处理；前列腺素E1

肝脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是肝移植术中常见的一种病理生理过程，可导致10%移植肝原发性无功能，还可增加术后急、慢性排斥反应的发生率，如何减轻移植肝IRI一直是肝胆外科的研究热点[1]。随着缺血后处理[2]概念的提出，其良好的临床可控性和可靠的保护效应引起人们的广泛关注。但目前尚未见药物后处理用于移植肝IRI的研究报道。在本研究中，笔者采用前列腺素E1（Prostaglandin E1，PGE1）后处理作用于缺血再灌注损伤的大鼠肝移植模型，观察其对肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、氧化指数超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的影响，阐明其对于移植肝IRI可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠60只（购自于河南省实验动物中心）。体重200～250 g，术前12 h禁食，自由饮水。PGE1注射液（北京泰德制药有限公司），SOD、MDA试剂盒（江苏省南京建成生物工程研究所），TNF-α正向引物：5'-CTTCTCATTCCTGCTCGTGG-3'，反向引物：5'-CCTCTGCTTGGTGGTTTGCT-3'，扩增产物大小为203 bp；β-actin正向引物：5'-GCGC GGCTACAGCTTCA-3'，反向引物：5'-CTTAATGTCA CGCACGAT-3'，扩增产物大小为68 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 动物模型及分组

参照“二袖套法”复制肝移植模型[3]，移植肝热缺血时间为0～1 min，冷缺血时间约90 min，受体无肝期为（20±3）min。将60只健康雄性SD大鼠随机分为3组：假手术（S）组12只，IRI组和药物后处理（PGE1）组各24只。S组：进腹后仅分离肝周韧带，不阻断肝门血管；IRI组：移植肝植入后立即完全开放门静脉，不予任何处理；PGE1组：移植肝复灌时经门静脉建立微输液泵通道，将PGE1注射液以0.02 μg/（kg·min）速度持续性泵入60 min。

1.3 检测项目及方法

各组在结束无肝期移植肝再灌注后第2及6小时分别处死6只大鼠，自下腔静脉采血3 ml，采用多功能生化分析仪测定肝功能[血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT），谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）]；用可见光分光光度计测其吸光度来计算血清SOD及MDA含量。切取部分新鲜肝组织置入-80℃冰箱冷冻保存备用，采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测肝组织内TNF-α信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表达水平。部分肝组织用体积分数为10.0%福尔马林溶液固定，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）观察移植肝病理形态学变化。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数间比较用单因素方差分析，多个均数间的两两比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝移植后各时间点血清ALT、AST水平

各组大鼠肝移植后第2及6小时血清ALT、AST水平较S组差异有统计学意义（P＜0.05），IRI组和PGE1组值相较于S组升高，但PGE1组比IRI组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

2.2 各组大鼠肝移植后各时间点血清SO D，M D A含量

各组大鼠肝移植后第2及6小时血清SOD，MDA含量的变化差异有统计学意义（P＜0.05）。相较于S组，IRI组和PGE1组值均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

2.3 各组大鼠肝移植后移植肝组织中TN F-α m R N A的表达

移植后2 h时S组移植肝组织中TNF-α mR-NA仅少量表达（0.02±0.01），IRI组（0.34±0.09）及PGE1组（0.23±0.06）的表达含量升高（t=2.491，P= 0.032）。再灌注6 h时，PGE1组（0.31±0.05）肝组织TNF-α mRNA的表达低于IRI组（0.44±0.11）（t= 2.635，P=0.025）（见图1）。

表1 各组大鼠肝移植后各时间点血清ALT、AST水平的变化（n=6，u/L±s）

表1 各组大鼠肝移植后各时间点血清ALT、AST水平的变化（n=6，u/L±s）

注：与IRI组比较，1）P=0.0001；2）P=0.0004；3）P=0.0001；4）P= 0.0082

A L T A S T组别6 h S组5 6 . 7 ± 7 . 3 6 4 . 4 ± 7 . 5 1 4 4 . 5 ± 2 4 . 1 1 6 4 . 6 ± 2 8 . 8 I R I组1 0 8 3 . 5 ± 1 5 2 . 2 1 5 1 0 . 3 ± 2 0 6 . 2 1 2 6 2 . 2 ± 1 5 3 . 4 1 6 1 7 . 2 ± 2 1 8 . 3 P G E 1组5 1 6 . 6 ± 1 5 3 . 41）1 0 1 4 . 4 ± 1 0 6 . 52）5 8 3 . 2 ± 1 3 4 . 33）1 2 2 4 . 4 ± 1 9 4 . 84）F值1 0 1 . 9 1 8 0 . 2 1 3 5 . 4 1 1 7 . 6P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 2 h 6 h 2 h

表2 各组大鼠肝移植后各时间点血清SO D、M D A含量的变化（n=6±s）

表2 各组大鼠肝移植后各时间点血清SO D、M D A含量的变化（n=6±s）

注：与IRI组比较，1）P=0.0001；2）P=0.0001；3）P=0.0015；4）P= 0.0029

组别S O D /（u / m l）M D A /（n m o l / L）6 h S组2 0 4 . 3 ± 8 . 2 2 1 1 . 6 ± 9 . 1 7 . 5 ± 1 . 2 7 . 6 ± 1 . 5 I R I组1 0 3 . 3 ± 6 . 2 9 6 . 5 ± 6 . 0 2 3 . 1 ± 3 . 9 2 5 . 8 ± 4 . 2 P G E 1组1 4 9 . 4 ± 7 . 21）1 3 2 . 1 ± 7 . 12）1 5 . 2 ± 2 . 23）1 7 . 9 ± 2 . 64）F值2 9 2 . 2 3 6 9 . 4 5 0 . 9 5 6 . 3P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 2 h 6 h 2 h

图13 组复灌后各时间点TN F-α m R N A表达结果

2.4 各组大鼠肝移植后肝组织的病理组织学改变

光镜下观察见S组大鼠肝组织结构未见明显异常改变，在再灌注第6 h时，IRI组肝细胞可见不同程度的浊肿变性和空泡样变性，呈气球样改变，并可见灶状坏死及炎症细胞聚集、浸润；PGE1组肝小叶结构损害较轻，可见散在肝细胞核浓缩、空泡变性，偶见单个肝细胞坏死（见图2）。

图2 各组大鼠肝移植后肝组织的病理组织学（HE染色×200）

3 讨论

IRI普遍存在于机体各组织器官中[4-6]，目前常用的预防IRI的方法是缺血或药物预处理。但对于已遭受缺血性打击的器官来说，预处理应用较局限。缺血后处理主要针对已缺血的器官，在再灌注开始时给予一系列短暂重复的机械性阻断再灌注血流，可最大程度地减轻器官的IRI[2]。由于其良好的临床可控性和可靠的保护效应引起人们的广泛关注。为更加适用于临床，有研究者将该种机械调控转变为药物干预，既药物后处理（pharmacological postconditioning，PPC），并在心脏IRI中取得预期的效果[7-8]。近来研究认为，缺血后处理可通过开放线粒体KATP通道（mitochondrial channel KATP）来保护肝脏的缺血再灌注损伤[9]。本研究将PGE1应用于大鼠移植肝，观察其是否能起到相似的保护作用。

肝脏IRI是移植术后肝脏损伤的重要因素。研究表明，IRI发生可能与钙超载、氧自由基及其引发的脂质过氧化反应等多种因素有关[5]。氧自由基的大量释放被认为是IRI的一个重要组成部分，缺血可使内源性抗氧化剂如SOD失活或者耗尽，氧自由基清除减少。该氧自由基可以直接氧化核酸、蛋白质和脂质等生物大分子，造成其结构的损毁、功能丧失；还能与生物膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，形成MDA。TNF-α主要由单核巨噬细胞（Kupf fer）产生，是肝脏缺血再灌注损伤的重要细胞因子，可通过多种途径诱导炎性介质活化和细胞浸润，造成肝细胞损伤、坏死与凋亡[10]。因此提高体内血清SOD的水平，降低肝组织TNF-α mRNA的表达有助于减轻移植肝IRI。

在本研究中，PGE1后处理明显降低大鼠血清MDA的含量及肝组织TNF-α mRNA的表达，提高SOD的水平，同时可减轻肝移植术后肝功能的损害。光镜下HE染色病理形态变化亦与上述各项变化规律相符。以上结果表明，PGE1后处理可通过减少再灌注后氧自由基的产生、减轻脂质过氧化反应，并降低细胞因子TNF-α的表达，来减轻移植肝IRI。此结果可能为临床移植肝IRI的防治提供新思路，为今后进一步研究打下基础。

[1]ZENG X P,LI X J,ZHANG Q Y,et al.Tert-butylhydroquinone protects liver against ischemia/reperfusion injury in rats through Nrf2-activating anti-oxidative activity[J].Transplantation Proceedings,2017,49(2)：366-372.

[2]ZHAO Z Q,CORVERA J S,HALKOS M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：Comparison with ischemic preconditioning[J].American Journal of Physiology Heart&Circulatory Physiology,2003,285(2)：579-588.

[3]马跃峰,李相成,游伟.“两袖套法”大鼠原位肝移植模型的技术改进[J].中国现代医学杂志,2006,16(2)：229-232.

[4]WENG W,ZHANG F,LINEAWEAVER W C,et al.The value of postconditioning in plastic and reconstructive surgery：a systematic review[J].Journal of Reconstructive Microsurgery,2016, 32(4)：285-293.

[5]SONG X,ZHANG N,XU H,et al.Combinedpreconditioning and postconditioning provides synergistic protection against liver ischemic reperfusion injury[J].International Journal of Biological Sciences,2012,8(5)：707-718.

[6]SAIDI SA,BOUROG?A E,BOUAZIZ A,et al.Protective effects of hammada scoparia flavonoid-enriched fraction on liver injury induced by warm ischemia/reperfusion[J].Pharmaceutical Biology, 2015,53(12)：1810-1817.

[7]ZHANG W P,ZONG Q F,GAO Q,et al.Effects of endomorphin-1 postconditioning on myocardial ischemia/reperfusion injury and myocardial cell apoptosis in a rat model[J].Molecular Medicine Reports,2016,14(4)：3992-3998.

[8]李艳芳,费丽萍,牛青英.阿托伐他汀及尼可地尔后处理对兔心肌缺血再灌注细胞自噬的影响[J].中国药物与临床,2016,16(4)：486-488.

[9]TIAN Y S,RONG T Z,HONG Y L,et al.Pharmacological postconditioningwithdiazoxideattenuatesischemia/reperfusion-induced injury in rat liver[J].Experimental&Therapeutic Medicine, 2013,5(4)：1169-1173.

[10]刘现忠,姚爱华,仲跻巍,等.缺血预处理对大鼠减体积肝移植缺血再灌注损伤的影响[J].中国现代医学杂志,2007,17(19)：2313-2317.

Protection effect of post-processing prostagandin E1 in rat liver transplantation ischemia-reperfusion injury*

Yu-zhu Wang1,Ying-zi Ming2[1.Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery,People's Hospital of Zhengzhou University
(Henan Provincial People's Hospital),Zhengzhou,Henan 450003,China;2.Xiangya Transplant Institute of Medicine,Central South University,Changsha,Hunan 410013,China)

ObjectiveTo study the protective effects and mechanisms of prostaglandin E1(PGE1)postconditioning in liver graft ischemia-reperfusion injury.MethodsThe liver transplantation rat model was used as ischemia-reperfusion injury animal model.The rats were randomly divided into three groups:ischemic reperfusion injury group(IRI),postconditional PGE1 treated group(PGE1)and sham operated group(S).The liver functional tests,SOD,MDA,TNF-α expression level and the histology were checked at 2 h and 6 h after reperfusion.ResultsThe ALT,AST,MDA in serum and TNF-α expression level in liver were significantly lower in PGE1 group than in IRI group(P＜0.05),the SOD was higher in the PGE1 group(P＜0.05).The tissue damage was significantly decreased in PGE1 group.ConclusionsProstaglandin E1 postconditioning has significant protective effect in ischemia-reperfusion injury,and part of those benefit effects dependent on decreased TNF-α expression level and increased SOD production.

livertransplantation;ischemicreperfusioninjury;pharmacologicalpostconditioning; prostaglandin E1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.004

1005-8982（2017）08-0017-04

2017-02-28

河南省科技攻关计划资助项目（No：162102310303）