受试者工作特征曲线分析在地中海贫血筛查中的应用价值

夏超然 黄 英 任兆瑞

上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院 上海交通大学医学遗传研究所 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室 上海市胚胎与生殖工程重点实验室（上海 200040）

·论 著·

受试者工作特征曲线分析在地中海贫血筛查中的应用价值

夏超然 黄 英 任兆瑞

上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院 上海交通大学医学遗传研究所 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室 上海市胚胎与生殖工程重点实验室（上海 200040）

目的用受试者工作特征（ROC）曲线评价胎儿血红蛋白（HbF）和HbA2在儿童地中海贫血筛查和诊断中的临床应用价值。方法分别采用经典法（醋纤法和Singer一分钟碱变性实验）和高效液相法（HPLC）对经基因检查确诊的200例地贫患儿和62例正常对照者进行HbF和HbA2定量检测。以基因检测结果为金标准，采用ROC曲线分析法，分析HbF、HbA2曲线下面积（AUC）以及选择不同切值对应的灵敏度和特异度，确定可行性筛查方案。结果α-和β-地中海贫血组中，HPLC法定量HbF、HbA2值的AUC均大于对应的经典方法定量结果的AUC；β-地中海贫血组中，HPLC法定量HbA2对应的AUC最大，为0.991。采用ROC曲线法分析得到的截断值，HbF（≥1.05%）、HbA（2≥3.75%）组成的联合筛查方案的诊断符合率、灵敏度、特异度可分别达到99.2%、99.0%和100.0%。结论在进行大规模β-地中海贫血筛查时，采用HPLC定量的截断值HbF（≥1.05）、HbA（2≥3.75）与血液学有关指标联合的筛查方案可提高筛查的灵敏度、符合率和筛查效率。

地中海贫血; 受试者工作特征曲线; 筛查指标; 血红蛋白

地中海贫血（thalassemia，简称地贫）是由于珠蛋白基因异常引起的一组血红蛋白表达失调的遗传性血液病，致病突变通过影响珠蛋白不同亚基相对数目以及血红蛋白空间结构等导致溶血[1]。在广东地区α-地贫和β-地贫的发病率分别高达12.03%、3.80%[2]。地贫常与结构异常的血红蛋白变异体相伴存在，它们之间复杂的相互作用导致了更加多样的临床表型。因此，相关筛查、诊断技术的完善与发展意义重大。目前，已有的文献资料大多是对发病率较高的区域进行的地贫流行病学调查，江浙沪地区儿童中该病的资料较少。近年来随着人口流动性增加，在原来发病率相对较低的某些地区，地贫携带者比例呈现上升趋势。选择合适的筛查指标，制定快速、高效的联合筛查方案，是降低漏诊和误诊率的有效措施。对HbA2（α2δ2）、HbF（α2γ2）的定量分析是筛查地贫的重要参考指标，常用方法包括醋酸纤维素薄膜电泳（简称醋纤法）、Singer一分钟碱变性实验、高效液相色谱（HPLC）等技术[3]。但是，应用HPLC定量检测HbF、HbA2对江浙沪地区儿童地贫的筛查评价尚缺乏明确的截断值（cut-off value），因此，通过相应的实验研究和统计分析确定这两个指标的最佳截断值对于提高该区域地贫筛查效率有重要价值。本研究对经基因诊断确诊的200例地贫患儿或杂合子和62名正常儿童进行筛查，即分别采用经典筛查方法中醋纤法和Singer一分钟碱变性实验定量测定10%溶血液中的HbF和HbA2，采用HPLC法定量测定外周血中的HbF和HbA2，对所有样本进行红细胞参数测定，以基因诊断结果作为临床诊断的金标准，采用受试者工作特征（ROC）曲线统计分析并比较不同方法定量测定HbF和HbA2的灵敏度、特异度，并确定相应的截断值，评价最佳截断值的HbF、HbA2在地贫筛查和诊断中的应用价值，为建立大规模地贫筛查方案提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014—2016年间在上海交通大学附属儿童医院经基因检查确诊的200例地贫患儿（或杂合子）作为病例组。研究对象入选标准：①年龄18个月～13岁；②经基因检测已确诊地贫；③有完整的临床资料及标本。另选择来院体检年龄相匹配的62名正常儿童作为正常对照组。对照组入选标准：①年龄18个月～13岁；②无任何地贫表现；③排除感染、缺铁性贫血等其他各种疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采用EDTA-K2真空抗凝管常规采集2 mL研究对象外周静脉血，分别按照生化实验和基因检测实验要求对血液进行预处理、分离与保存（4℃）。

1.2.2 地贫的基因诊断 采用跨跃断裂点PCR（GAP-PCR）法检测α-地贫的缺失[东南亚型（SEA）、3.7/4.2]；采用反向点杂交（RDB）法检测α-地贫突变[金斯敦型（CS）、广西型（QS）、威斯密型（WS）]和β-地贫17种中国人群常见突变[3]。

1.2.3 血液学指标检测 采用 SYSMEX XS-800i全自动血细胞分析仪（日本），按照标准操作规程对全血细胞Hb、红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均红细胞血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）和红细胞平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）进行测定，并作好室内质量控制，24 h内完成检测[3]。

1.2.4 全自动HPLC分析 采用D-10TMDual HbA2/ F/A1cProgram（美国），按照操作说明进行HbA2、HbF和HbA1c含量测定。结果以各组洗脱面积占总洗脱面积的百分比来表示。同时应用Westgard 质控规则12s /13s 22sR4s进行室内质量控制[3,4]。

1.2.5 HbF Singer一分钟碱变性实验 将50 μL 10%的血红蛋白溶血液和800 μL 0.083 mol/L NaOH（pH值12.7）混合，剧烈振荡1 min，用酸性半饱和硫酸铵溶液终止反应，于540 nm波长下测定滤液光密度值[3]。

1.2.6 HbA2醋酸纤维薄膜电泳 以醋酸纤维薄膜为支持物，在电压30 V/cm、硼酸缓冲液中电泳20 min，将对应条带用ddH2O洗脱，于415 nm波长下测定光密度值[3]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件，绘制ROC曲线，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）及各参数截断值的灵敏度、特异度。偏态计量资料以中位数表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验；比较不同定量方法检测HbF、HbA2在经验值、推荐截断值和ROC最佳截断值处的灵敏度、特异度。

2 结果

2.1 研究对象一般情况和基因检测结果

病例组200例样本，包含β-珠蛋白基因突变115例，其中男69例、女46例，α-珠蛋白基因突变85例，其中男50例、女35例；正常对照组中62例儿童的基因检测显示均无α-和/或β-珠蛋白基因异常，其中男22例、女40例。病例组中位年龄6.5岁（18月龄～13岁），正常对照组中位年龄6岁（20月龄～14岁），两组年龄比较差异无统计学意义（Z=1.84，P=0.066）。正常对照组与α-地贫组（χ2=0.001，P=0.981）、β-地贫组（χ2=0.005，P=0.945）的性别差异均无统计学意义。

2.2 HbF、HbA2不同定量测定结果的筛查价值

α和β-地贫组中，HPLC法定量HbF、HbA2值的AUC均大于对应的经典方法定量结果；β-地贫组中HPLC法定量HbA2的AUC最大，为0.991，表明其对β-地贫诊断的准确性较好，与金标准的符合率较高。β-地贫组中，HPLC法与醋纤法定量HbA2的AUC均高于0.900，高于HPLC法与Singer一分钟碱变性法定量HbF的AUC。见表1。

β-地贫组中，HPLC法和Singer一分钟碱变性法定量HbF的最佳临界值分别为1.05%、0.805%，前者对应的灵敏度、特异度均高于后者。HPLC法和醋纤法定量HbA2的最佳临界值分别为3.75%、2.85%，前者对应的灵敏度、特异度均高于后者。α-地贫组中，HPLC法和经典法测得的HbF的最佳临界值分别为2.45%、2.03%，前者对应的灵敏度、特异度均高于后者。见表1、图1、图2。

2.3 HbF、HbA2截断值确立对β-地贫筛查的影响

本研究采用Singer一分钟碱变性实验定量HbF的经验值1.31%作为判断标准，结果高于1.31%判定为异常；采用HbA2醋纤法定量HbA2的经验值3.5%作为判断标准，结果高于3.5%判定为异常；同时采用HPLC定量测定HbF、HbA2的试剂盒推荐截断值1.0%、4.0%作为判断标准，结果高于1.0%和/或4.0%判定为异常。

β-地贫组中，采用醋纤法定量HbA2时，分别将3.5%和ROC曲线分析所得的最佳截断值2.85%作为判断标准，对应的约登系数分别为0.833、0.885；采用最佳截断值2.85%对应的阳性预测值、阴性预测值均高于采用3.5%时的对应值，且阴性似然比明显降低。见表2。采用HPLC法定量HbA2时，分别将4.0%和ROC曲线分析的最佳截断值3.75%作为判断标准，对应约登系数由0.936提高到0.961，阴性预测值由0.968提高到0.984。见表2。

2.4 HbF、HbA2截断值确立对筛查方案效率的影响

图1 β-地贫组中两种定量HbF方法的ROC曲线分析

图2 β-地贫组中两种定量HbA2方法的ROC曲线分析

采用ROC曲线分析得到的截断值HbF（≥1.05%）、HbA2（≥3.75%）组成的联合筛查方案的符合率、灵敏度、特异度均高于选择推荐截断值HbF（≥1.0%）、HbA2（≥4.0%或≥3.5%或≥3.0%）组成的联合筛查方案，其基因诊断符合率、灵敏度、特异度可分别达到99.2%、99.0%和100.0%。见表3。

表1 两种定量检测方法对应指标的AUC、最佳截断值及其灵敏度、特异度

3 讨论

地中海贫血在我国发病率较高，携带者数目巨大，且目前尚无有效根治办法，因此开展地贫筛查并完善筛查方案意义重大。由于地贫经常与多样化的血红蛋白变体共存，这些数目异常和/或结构异常的血红蛋白组分间的相互作用导致地贫有更加多样的表型，大大增加了其诊断的复杂性。有研究表明，通过对红细胞参数，如Hb、MCV、MCH、MCHC等的异常筛查地贫患者是可行的，但其准确性、灵敏度仍较低，容易误诊或漏诊[5-7]。DNA分析是诊断地贫的金标准，但是基因检测目前尚不能覆盖全部α-或β-珠蛋白基因，患者存在异常血红蛋白变异、非常见突变的珠蛋白基因和未知突变等情况时则需通过DNA测序来确定；且基因检测成本高，不适用于大规模筛查。HbF、HbA2是地贫筛查的重要参考指标，经典的定量HbF、HbA2的方法有Singer一分钟碱变性实验和醋纤法。近年来基于离子交换原理的HPLC法已被证实在筛查地贫，尤其是β-地贫时具有重要价值[3,8-10]。然而目前应用HPLC定量HbF、HbA2进行地贫筛查尚没有明确的参考截断值，因此实验室确定HPLC定量检测HbF、HbA2的最佳临界值是提高地贫筛查效率、完善筛查方案的关键。

表2 两种方法定量HbA2在β-地贫筛查时的推荐截断值、最佳截断值处的评价

表3 HbF、HbA2截断值确立对筛查方案效率的影响 （%）

本研究采用ROC曲线分析评估不同方法定量HbF、HbA2在地贫筛查中的价值，比较两种定量方法对地贫筛查的价值，并确定相应指标的截断值供临床实验室参考。ROC曲线分析不仅反映了不同指标的灵敏度、特异度的关系，还比较了不同实验方法对某一指标的灵敏度、特异度[11-14]。ROC分析结果显示，首先，HPLC法定量HbF、HbA2在最佳临界值处的灵敏度、特异度均高于经典法的对应值，说明HPLC法定量HbF、HbA2进行地贫筛查的效果优于经典方法。其次，两种定量检测HbF的方法对β-地贫组的诊断效果和准确性均高于α-地贫组。HPLC法与醋纤法定量HbA2对β-地贫的筛查有较高的准确性；HPLC定量HbA2对β-地贫筛查的准确性较好，与基因诊断结果的符合率最高。第三，本研究重点比较了推荐截断值和ROC分析最佳截断值对筛查方案效率的影响，结果显示采用ROC分析得到的HPLC 法定量HbF（≥1.05%）、HbA2（≥3.75%）的切值可以有效地提高地贫联合筛查方案的灵敏度和与金标准的符合率。需要说明的是，由于仪器的测定范围，如果HbF%在0.8%～16.5%范围外或检测的HbA2%在1.5%～11.4%范围外，测定结果还需结合峰图综合分析。

综上所述，应用对检测过程的室内质控还可以保证结果的准确性和可靠性。本研究提示，在进行β-地贫筛查时，采用HPLC定量的截断值HbF（≥1.05）、HbA2（≥3.75）与红细胞参数MCV（＜80 fl）、MCH（＜27 pg）组成的联合筛查方案，可以有效地提高地贫筛查的效率，为临床上进行地中海贫血的大规模筛查提供了参考。

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Clinical signi fi cance of receiver operating characteristic curve analysis in the screening of thalassemia

IA Chaoran,

HUANG Ying, REN Zhaorui
（Shanghai Institute of Medical Genetics; Shanghai Children’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Key Lab of Medical Embryo Molecular Biology; Ministry of Health, and Shanghai Lab of Embryo and Reproduction Engineering, Shanghai 200040, China）

ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the application of receiver operating characteristic (ROC) curve of biochemical indexes of blood for HbF and HbA2on the screening and diagnosis of thalassemia in children.MethodsThe traditional methods (cellulose acetate membrane electrophoresis and single one minute alkaline denaturation) as well as HPLC were used to quantitatively detecting HbF and HbA2in 200 thalassemic cases and 62 normal controls. With DNA analysis as a golden standard for thalassemia diagnosis, ROC was applied to evaluate the indicators of HbF and HbA2including areas under the curve (AUC), sensitivity and speci fi city after different cut-off values chosen.ResultsIn α- and β-thalassemia groups, all of AUC of HbF and HbA2quanti fi ed by HPLC were higher than that detected by the classical method. In the β-thalassemia group, the AUC of HbA2quanti fi ed by HPLC showed the greatest value (0.991). The coincidence rate, sensitivity and speci fi city of the combined screening scheme of the cut-off value HbF (≥1.05%) and HbA2(≥3.75%) analyzed by ROC were 99.2%, 99.0%, and 100%, respectively.ConclusionsIt is suggested that the combined screening scheme, the cut-off value of HbF (≥1.05) and HbA2(≥3.75) measured by HPLC, together with the related hematological indexes, may be applied to the large-scale screening of β-thalassemia. This scheme can improve the sensitivity, coincidence rate and screening ef fi ciency. The internal quality control for the detective process ensured the accuracy and reliability of the results, and reduced the misdiagnosis rates.

thalassemia; receiver operating characteristic curve; screening indicator; hemoglobin

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.005

2016-10-24)

(本文编辑：蔡虹蔚)

国家科技支撑计划资助项目（No.2012BAI09B04）

任兆瑞 电子信箱：zhrren1225@163.com